防风多糖体内外免疫调节活性研究
作者：无忧期刊网 来源：期刊论文 日期：2023-08-25 08:26人气：
摘 要：目的采用体内外多指标免疫调节活性评价方法，研究防风多糖体内外免疫功能的调节作用。方法体外实验选用RAW264.7小鼠巨噬细胞系，采用CCK-8法检测巨噬细胞的增殖能力，中性红染色法检测巨噬细胞的吞噬能力，Griess法测定巨噬细胞NO释放量，ELISA法测定巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6释放量。体内实验选用环磷酰胺诱导的免疫低下BALB/c小鼠，通过碳粒廓清实验探讨防风多糖对小鼠网状内皮系统吞噬功能，以小鼠免疫器官指数评价防风多糖对小鼠免疫器官的影响，并采用ELISA法测定小鼠体内免疫球蛋白（IgM、IgG、IgA）和补体（C3、C4）含量。结果体外实验结果表明，防风多糖能够显著提高巨噬细胞的增殖和吞噬能力，并促进巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-6，但对IL-1β的释放量影响不显著。体内实验结果表明，防风多糖可使免疫低下小鼠模型的吞噬能力和免疫器官指数显著提高，并使免疫低下小鼠体内的免疫球蛋白IgM、IgG、IgA和补体C3、C4的含量升高。结论防风多糖在体内外水平均具有较好的免疫调节活性，参与调解机体的特异性免疫和非特异性免疫。
关键词:防风;多糖;免疫调节;特异性免疫;非特异性兔疫;
Study on the evaluation of immunoregulatory activity of polysaccharide from Saposhnikovia
divaricata in vitro and in vivo
Abstract：Objective The immunoregulatory activity of Saposhnikovia divaricata polysaccharides was evaluated in vitro and in vivo. Methods In vitro, RAW264.7 mouse macrophage system was used to detect the proliferation of macrophages by CCK-8 method, the phagocytosis of macrophages by neutral red staining, the NO release of macrophages by Griess method, and the TNF-α, IL-1β and IL-6 of macrophages was measured by ELISA. In vivo experiments were carried out in immunocompromised BALB/c mice induced by cyclophosphamide. The phagocytosis function of Saposhnikovian polysaccharide on reticuloendothelial system of mice was studied by carbon particle clearance test. The effect of Saposhnikovian polysaccharide on immune organs of mice was evaluated by mouse immune organ index. The content of immunoglobulin (IgM, IgG, IgA) and complement (C3, C4) in mice was determined by ELISA. Results The results in vitro showed that Saposhnikovia polysaccharide could significantly improve the proliferation and phagocytosis of macrophages, and promote the release of NO, TNF-α and IL-6, but the effect on the release of IL-1β was not significant. The results of in vivo experiments showed that Saposhnikovia polysaccharide could significantly improve the phagocytic capacity and immune organ index of immunosuppressed mice, and increase the content of immunoglobulin IgM, IgG, IgA and complement C3, C4 in immunosuppressed mice. Conclusion Polysaccharides from Saposhnikovia divaricata have good immunoregulatory activity both in vivo and in vitro, and participate in regulating specific and non-specific immunity of the body.
Keyword：Saposhnikovia divaricate; polysaccharide; immunomodulation; specific immunity; non-specific immunity;
防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.的干燥根，味辛、甘，微温，归膀胱、肝、脾经[1]，主要含有多糖、色原酮、香豆素以及挥发油等化学成分[2,3,4,5,6,7]。其中，多糖是防风重要的活性成分之一，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等药理作用，有研究表明防风多糖发挥药效的作用基础与其免疫调节作用息息相关[8,9,10,11]。目前以评价防风多糖免疫调节作用为目的的研究较少，存在研究指标单一，评价体系不够完善等问题，在评价防风多糖免疫调节活性时具有一定的局限性。本文采用了体内外多指标免疫调节活性评价方法，体外研究以RAW264.7巨噬细胞的增殖能力，吞噬能力，NO释放量，TNF-α、IL-1β和IL-6释放量为评价指标；体内研究以环磷酰胺诱导的免疫低下BALB/c小鼠网状内皮系统吞噬功能，免疫器官指数，免疫球蛋白（IgM、IgG、IgA）和补体（C3、C4）含量为评价指标，拟从特异性免疫和非特异性免疫两个方面，对防风多糖的免疫调节作用进行全面系统的评价，明确防风多糖在体内外免疫调节活性，为防风多糖免疫调节作用的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
防风多糖[12]（FF，实验室自制，多糖含量为50.50%）；RAW264.7巨噬细胞，国家实验细胞资源共享平台（北京总部）；DMEM高糖培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清，澳洲AusGeneX公司；CCK-8试剂盒，美国Genview公司；中性红，德国Sigma公司；NO试剂盒，中国Beyotime公司；TNF-α、IL-6、IL-1β试剂盒，美国ABclonal公司；环磷酰胺，德国Sigma公司；盐酸左旋咪唑，上海麦克林生化科技有限公司；印度墨汁，北京雷根生物技术有限公司；免疫球蛋白（IgG）、免疫球蛋白（IgA）、免疫球蛋白（IgM）、补体（C3）、补体（C4）试剂盒，南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
Spectra-Max-190型酶标仪，美国分子仪器公司；BT-25S型电子分析天平，北京Sartorius公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；Sigma3-16P离心机，德国Sigma公司；超低温冰箱（MOF-U3386S），日本SANYO公司；高压蒸汽灭菌锅（AUTOCLAVE），日本SANYO公司；倒置显微镜（TE 2000-S），日本Nikon公司。
1.3 动物饲养
BALB/c雄性小鼠，3 ~ 5周龄，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010。饲养于北京中医药大学动物房，动物伦理审查编号为BUCM-4-2020110606-4179，12 h昼夜循环，室温恒定在22 ~ 24 ℃，相对湿度为55% ~ 65%。
1.4 实验方法
1.4.1 防风多糖体外免疫调节活性评价研究
1.4.1.1 主要溶液配制
防风多糖（FF）溶液：称取FF适量，加入DMEM高糖完全培养基，制成1 mg/mL的FF母液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
阳性药脂多糖（LPS）溶液：称取LPS适量，加入PBS缓冲盐溶液，制成1 mg/mL的LPS母液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
0.1%中性红溶液：称取0.1 g中性红粉末，加10 mL PBS缓冲盐溶液，充分溶解，过0.22 μm滤膜，续滤液为1%的中性红母液。使用时，吸取中性红母液1 mL，加PBS 9 mL，摇匀得0.1%中性红溶液。
乙酸乙醇裂解液：分别吸取5 mL的冰醋酸和5 mL的无水乙醇，置于50 mL离心管中，加入10 mL去离子水，混匀，得乙酸乙醇裂解液，现配现用。
1.4.1.2 巨噬细胞增殖能力
选用对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，空白对照组加入DMEM高糖完全培养基，给药组分别加入不同浓度（7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000 μg/mL）FF溶液，每组设置6个复孔。孵育24 h后，每孔加入含有10% CCK-8的DMEM高糖完全培养基，设置调零孔，置于5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中孵育，待孵育1 h时取出，于450 nm处测定吸光度，计算各组巨噬细胞增殖率。
1.4.1.3 巨噬细胞吞噬能力
选用对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，空白对照组加入DMEM高糖完全培养基，给药组分别加入不同浓度（250、500和1000 μg/mL）FF溶液，阳性药组给予1.5 μg/mL的LPS溶液，每组设置6个复孔，设置调零孔。培养24 h后，每孔加入0.1%中性红溶液，继续培养20 min，弃除中性红溶液，采用PBS清洗3遍，加入乙酸乙醇裂解液裂解1 h，于540 nm处测定吸光度，计算各组巨噬细胞吞噬率。
1.4.1.4 巨噬细胞一氧化氮释放量
选用对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，空白对照组加入DMEM高糖完全培养基，给药组分别加入不同浓度（100、200、400和800 μg/mL）FF溶液，阳性药组给予1.5 μg/mL的LPS溶液，每组设置3个复孔，培养24 h。按50 μL/孔在96孔板中加入标准品及样品，标准品（1 mol/L NaNO2）依次在孔中稀释成5、10、20、40、60、100 μmol/L，样品组各孔吸50 μL细胞上清液于96孔板中，于每孔加入50 μL Griess Reagent Ⅰ，再立即加入50 μL Griess Reagent Ⅱ，于540 nm处测定吸光度值，依据标准品曲线，计算出不同样品组细胞NO的释放量。
1.4.1.5 巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量
选用对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，同“1.4.1.4 巨噬细胞一氧化氮释放量”项下铺板和给药方法，收集细胞上清液于2 mL Ep管中，离心（1000 r/min，10 min），待测。
将各标准品依次梯度稀释得到250、125、62.5、31.25、15.625 pg/mL的标准液，待用。分别取出TNF-α、IL-1β和IL-6试剂盒中的微孔板条，每孔加入1×洗涤缓冲液350 μL，重复洗涤3次；在空白孔中加入100 μL样本稀释液R1，在其他孔中分别加入不同浓度的标准品和样品，使用封板膜小心封闭板孔，于37 ℃孵育2 h，弃去液体；使用生物素化抗体稀释液R2将浓缩生物素化抗体以1:100的比例稀释，洗涤3次，每孔加入现配的生物素化抗体工作液（100 μL/孔），封上封板膜，37 ℃孵育1 h。提前15 min以1:100的比例稀释浓缩链霉亲和素-HRP，重复洗涤，每孔加入100 μL链霉亲和素-HRP（1×）工作液，封膜，于37 ℃孵育30 min，弃去孔内液体，重复洗涤操作。向孔中加入100 μL TMB底物，于37 ℃下避光孵育20 min，加入终止液（50 μL/孔），立即于450 nm处测定OD值，根据梯度稀释标准品的吸光度值绘制的标曲计算出样品的浓度。
1.4.2 防风多糖体内免疫调节活性评价研究
1.4.2.1 给药方案
将BALB/c小鼠预饲养5天后，随机分为空白对照组（Control）、模型组（Model）、低剂量组（FF low does）、中剂量组（FF middle does）、高剂量组（FF high does）和阳性药组（Postive），每组各8只。除空白对照组外，其余五组连续3天腹腔注射0.1 mL/10g环磷酰胺（50 mg/kg）进行免疫抑制，3天后，低剂量组灌服25 mg/kg FF溶液，中剂量组灌服50 mg/kg FF溶液（按照《中国药典》（2020版）中防风饮片最高剂量换算），高剂量组灌服100 mg/kg FF溶液，阳性药组灌服30 mg/kg盐酸左旋咪唑溶液，空白对照组灌服等量生理盐水。所有溶液均由0.9%生理盐水配制，连续灌胃14天，每天灌服0.1 mL/10g，期间正常饮食饮水。
1.4.2.2 碳粒廓清能力
末次给药后，禁食不禁水2 h，称重。每组小鼠尾静脉注射印度墨汁0.1 mL/10g，分别于2 min和12 min眼眶取血20 μL，迅速转移至含有2 mL的0.1% Na2CO3溶液中混匀，于600 nm处测量其吸光度值。小鼠脱颈处死后，取其脾脏、肝脏，称重。以吞噬指数α表示小鼠碳粒廓清的能力，如公式（1）所示：
K=(lgOD1−lgOD2)/(t2−t1)�α=体重/（肝重+脾重）×K1/3（1）
其中OD1为t1（2 min）血样的OD值，OD2为t2（12 min）血样的OD值。
1.4.2.3 免疫脏器指数
末次给药后，禁食不禁水24 h，称重，以颈椎脱臼法将小鼠处死，解剖分离出完整的胸腺和脾脏，生理盐水洗净、滤纸吸干后称重，计算其胸腺指数和脾脏指数。
1.4.2.4 血清中IgM、IgG、IgA、C3、C4含量
末次给药后，禁食不禁水24 h，称重，将全部小鼠摘眼球取血，室温自然冷凝1 h，低温冷冻离心（4 ℃，3000 r/min，20 min），仔细取血清于Ep管中。取出各试剂盒中的微孔板条，向标准孔中依次加入50 μL梯度稀释的标准品，待检测样品孔中加入50 μL收集的小鼠血清稀释液，零孔加50 μL样品稀释液，空白孔不加样。除空白孔外，每孔加入50 μL生物素抗原工作液盖上封板膜，37 ℃培养箱孵育30 min，洗涤5次。依次加入50 μL亲和素-HRP到除空白孔之外的所有孔中，37 ℃培养箱孵育30 min，再次洗涤5次，每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min，快速加入50 μL终止液终止反应，于450 nm处检测各孔吸光度值。
1.4.3 统计方法
所有数据均以平均值 ± 标准误差（SEM）表示。首先将数据进行正态、方差齐性检验后，符合正态分布的数据使用one-way ANOVA进行分析，不符合正态分布的数据的显著性采用Kruskal-Wallis分析，采用GraphPad Prism 8.0软件进行图形绘制，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 防风多糖体外免疫调节活性评价研究结果
2.1.1 巨噬细胞增殖能力
如图1所示，与空白对照组相比，FF在7.8125 ~ 1000 μg/mL的浓度范围内均未产生明显的毒性作用，且以剂量依赖的方式提高细胞的增殖能力（P < 0.001），表明FF具有较好地提高巨噬细胞增殖的作用。
2.1.2 巨噬细胞吞噬能力
如图2所示，与空白对照组相比，当FF浓度为250 μg/mL时，对巨噬细胞吞噬能力无显著影响；当FF浓度在500 μg/mL和1000 μg/mL时，巨噬细胞的吞噬能力分别为（131.6 ± 13.28）%和（132.9 ± 8.662）%，表明FF可显著提高巨噬细胞的吞噬能力。
2.1.3 巨噬细胞NO释放量
如图3所示，与空白对照组相比，当浓度为200 μg/mL时，NO的释放量显著提高（P < 0.05），；在浓度分别为400 μg/mL和800 μg/mL时，NO的释放量分别与空白对照组相比，表现出了更为明显地促进巨噬细胞释放NO的能力（P < 0.001）。
2.1.4 巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量
如图4所示，与空白对照组相比，FF在100 ~ 800 μg/mL浓度范围内均表现出较强的刺激巨噬细胞释放TNF-α的能力（P < 0.001）；FF在400 μg/mL和800 μg/mL浓度时具有显著刺激巨噬细胞IL-6释放的能力（P < 0.001），并呈现出一定的剂量依赖性；FF对于刺激巨噬细胞释放IL-1β的能力较弱，差异无统计学意义。表明FF具有刺激巨噬细胞释放TNF-α和IL-6的作用。
2.2 防风多糖体内免疫调节活性评价研究结果
2.2.1 碳粒廓清能力
结果如图5所示，当模型组与空白对照组相比，小鼠吞噬指数显著降低（P < 0.001），说明环磷酰胺使正常小鼠的吞噬能力变低，影响了小鼠的吞噬功能。给药组随着给药剂量的增加，与模型组相比，小鼠的吞噬能力逐渐恢复，其中中剂量组（P < 0.01）和高剂量组（P < 0.001）的吞噬指数均显著高于模型组。表明FF能够显著提高免疫低下小鼠的碳粒廓清能力，反映出FF提高免疫低下小鼠的吞噬能力。
2.2.2 免疫脏器指数
小鼠胸腺和脾脏指数具体变化情况如图6所示。解剖后观察小鼠胸腺和脾脏，与空白对照组相比，腹腔注射环磷酰胺的小鼠胸腺和脾脏均出现不同程度的萎缩现象。通过分析脾脏和胸腺的重量与体重的比值，发现模型组与空白对照组相比，均显著性降低（P < 0.001），说明环磷酰胺影响了小鼠重要的免疫器官，小鼠免疫低下模型造模成功；与模型组相比，高剂量组的脾脏指数（P < 0.05）与胸腺指数（P < 0.01），均显著增加。表明FF具有提高免疫低下小鼠重要免疫器官重量的作用。
2.2.3 血清中IgM、IgG、IgA、C3、C4含量
通过分析免疫球蛋白IgM、IgG、IgA和补体C3、C4含量，发现与空白对照组相比，模型组5种生化指标的含量均显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）。其中中剂量组、高剂量组免疫球蛋白IgM、IgG和IgA以及补体C3、C4含量均比模型组含量显著上升，差异有统计学意义（P < 0.05）；低剂量组仅有免疫球蛋白IgM含量比模型组显著升高（P < 0.001），结果如图7所示。表明FF具有提高免疫低下小鼠血清中IgM、IgG、IgA、C3、C4含量的作用。
3 结论
本文对防风多糖免疫调节作用进行了系统评价，其中，体外研究选用RAW264.7细胞作为模型，其源于Abelson白血病BALB/c小鼠的病毒转化的单核细胞/巨噬细胞系[13]，在巨噬细胞介导的免疫、代谢和吞噬功能方面具有良好特征[14]，是常用的研究免疫功能的细胞模型之一。体内研究选用环磷酰胺诱导的免疫低下BALB/c小鼠作为模型，环磷酰胺是目前临床上广泛应用的一种烷化剂抗肿瘤药物，但是在治疗过程中会使免疫系统受损，导致免疫功能下降[15,16]。BALB/c小鼠的肝脏、脾脏等网状内皮细胞的器官与自身体重相比所占比值较大，是作为研究机体免疫相关指标的良好模型。
巨噬细胞是人体重要的固有免疫细胞之一，其通过释放多种细胞因子激活获得性免疫反应[17,18,19,20]。本研究发现防风多糖可以直接影响RAW264.7巨噬细胞的增殖和吞噬能力，增强了细胞的非特异性免疫。NO是参与机体炎症和免疫调节的重要媒介[21,22]，NO分泌量的增加，可促使巨噬细胞吞噬能力增强，强化机体的抗病能力[23]。TNF-α在宿主防御系统中起着关键作用，诱导许多免疫调节反应的发生[24,25]，促进感染部位的趋化因子及白细胞介素的分泌[26]，从而起到清除被感染部位病原微生物的作用。IL-6可促进细胞的吞噬和粘附作用，是巨噬细胞发挥免疫功能的重要生物活性细胞因子，TNF-α的大量分泌可刺激IL-6的产生，调控T细胞的活化、B细胞的分化及淋巴细胞的分型，发挥非特异性免疫调节作用[27,28]。
小鼠体内单核巨噬细胞的吞噬功能是衡量机体免疫能力的重要标志之一，本研究通过碳粒廓清实验发现防风多糖直接影响机体的非特异性免疫功能。胸腺和脾脏是机体细胞免疫和体液免疫的核心，既参与特异性免疫反应，又参与非特异性免疫，防风多糖通过影响胸腺与脾脏重量指数可以粗略的提示机体的免疫功能情况。免疫球蛋白在免疫过程中能与相应抗原物质发生特异性结合，介导天然免疫，刺激巨噬细胞并促进其吞噬作用，在体液免疫中发挥重要作用[29,30,31,32,33]。补体系统是增强抗体和吞噬细胞功能的关键组成部分[34]，活化后的补体参与调节适应性免疫应答，调节吞噬细胞的吞噬作用，清除病原体和感染细胞，发挥免疫作用。
防风在中药复方的临床药用中发挥着提高机体免疫功能的疗效，如在对玉屏风散进行拆方药理研究发现，防风作为使药发挥着调节机体免疫功能的作用[35,36]；在防风通圣散中，防风可通过调节免疫相关信号通路改善机体免疫功能及炎症反应，达到提高机体免疫功能的作用[37]。但目前，对于防风发挥免疫调节作用的机制尚不明确，因此，系统全面地探究防风多糖对于免疫调节作用的影响至关重要。本研究通过采用体内外多指标的评价方法，研究防风多糖免疫调节作用，发现防风多糖在体内外水平均具有较好的免疫调节活性，参与调解机体的特异性免疫和非特异性免疫，未来有望成为有效的免疫调节剂，其开发和应用对于提高机体免疫力低下具有重要意义。
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