疟疾传播阻断疫苗的研究进展
作者：忘忧期刊网 来源：文阅范文部 日期：2022-11-10 09:23人气：
摘 要：疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。蚊虫易被疟原虫感染并传播病原体是消除疟疾面临的一个巨大挑战。疟疾传播阻断疫苗旨在阻断疟原虫在蚊体内的生活史过程，免除蚊的感染，从而阻止疟疾传播。与其他防控策略联合使用，有望促进流行区疟疾的消除乃至根除。本文综述了疟疾传播阻断疫苗的研究进展，并对传播阻断免疫进行概述，以期为疟疾传播阻断疫苗的研制提供理论参考。
关键词:疟疾;传播阻断疫苗;配子体;免疫;综述;
Progress of research on malaria transmission blocking vaccines
WANG Shan-shan ZHAO Long-yu Quan Xin XUE Qing-jie TAN Wen-bin LI Shi-gen DU
Feng
Department of Patholgy,Institute of Precise on Medicine ,Jining Medical University Department of
Pathogenic Biology,Jining Medical University
Abstract：Malaria is the deadliest insect-borne disease caused by Plasmodium parasites, which are spread to people through the bites of infected female Anopheles mosquitoes. The efficient spread of malaria from infected humans to mosquitoes is a major challenge for malaria elimination initiatives. Malaria transmission blocking vaccines(TBVs) target Plasmodium stages that transmit between human and mosquitos in order to interrupt the parasite's life cycle and reduce spread. Combined with other prevention and control strategies, TBVs could contribute to malaria elimination from affected communities and malaria eradication worldwide. This article reviews the recent developments in TBVs and the transmission-blocking immunity in order to provide a theoretical reference to the development of TBVs.
Keyword：malaria; transmission blocking vaccines(TBVs); gametocyte; immunity; review;
疟疾是威胁人类生命的重要传染性疾病,病原体疟原虫通过雌性按蚊传播。与艾滋病、结核病并称为世界三大主要公共健康威胁。可致人类感染的疟原虫共有5种,其中恶性疟原虫和间日疟原虫危害最大。恶性疟原虫具致命性,在非洲较为流行;间日疟原虫是撒哈拉以南非洲之外大多数国家的主要流行虫种。疟疾可防可治,但据WHO《2021年世界疟疾报告》,2020年全球疟疾的新发病例约为2.41亿例,死亡人数约为62.7万人[1],且随着疟原虫耐药和蚊虫抗药问题的加剧,疟疾的防控任务艰巨。加之当下全球新冠肺炎的大流行,使疟疾的防控变得更加复杂。我国自2017年以来,无本土原发感染疟疾病例,现已获得WHO消除疟疾认证,可每年均有输入性病例的存在,在新型冠状病毒肺炎流行的2020年,非必要不出行的情形下,全国31省(直辖市、自治区,不含台湾、香港和澳门地区)仍有输入性病例1 085例[2]。而随着到国外务工、经营、旅游、求学及我国援非活动增多,使我国的疟疾防控任务仍十分艰巨。疟原虫借蚊虫高效的传播是疟疾防控的巨大挑战。传播阻断疫苗(transmission blocking vaccines,TBVs)针对蚊体内配子发生、雌雄性配子受精、合子形成及动合子穿透蚊中肠上皮细胞等有性期发育(图1),产生阻止蚊体内疟原虫配子生殖的免疫反应。TBVs虽然不能阻止受试者被感染,但能阻断疟疾的传播,亦可防止感染者将疾病带到非流行区或带回本土造成流行。TBVs的研制将对全球疟疾的防控和我国疟疾消除后的巩固及下一步的根除具有重要意义。
疟原虫的生活史需经历人体内和雌性按蚊体内的两个发育阶段。在人体内,先后在肝细胞和红细胞内寄生,进行无性裂体生殖,并有小部分寄生于红细胞内的疟原虫分化为雌雄配子体。恶性疟原虫配子体的形成时间约需10～12 d,经历Ⅰ-Ⅴ期的形态变化,未成熟的Ⅰ-Ⅳ期配子体一般在骨髓、脾脏等内部器官中发育[3],至成熟的Ⅴ期配子体被释放于外周血。间日疟原虫配子体的发育明显快于恶性疟原虫,发育至成熟仅约需48 h,亦可能存在骨髓期的器官内发育[4]。成熟的配子体与红内期的无性阶段疟原虫一样,寄生在宿主的红细胞内,恶性疟原虫成熟配子体形似新月,间日疟原虫成熟配子体呈圆形,当其随吸血进入蚊中肠后,在温度下降、p H升高及黄嘌呤酸等因素的刺激下[5],雌配子体发育为雌配子,雄配子体出丝发育为雄配子,雌雄配子受精后形成合子,再转化为动合子,穿过按蚊中肠壁上皮细胞或其间隙,在中肠壁弹性纤维膜下形成卵囊,最终经孢子生殖产生数以万计的对人体具有感染性的子孢子(图1)。针对蚊中肠内疟原虫表面蛋白的抗体可以阻断这种传播周期,由此产生了疟疾TBVs的开发,并已有一些疫苗进入了临床试验阶段。本研究回顾主要的疟疾TBV候选抗原及其目前的研究进展,归纳新型疟疾TBV候选抗原的研究思路,简述疟疾TBV相关的免疫。以期为疟疾TBVs的研究提供参考。
1 传播阻断疫苗候选抗原
针对蚊体内疟原虫有性生活史阶段，传播阻断疫苗候选抗原可分为两大类。一类是红细胞内配子体表面已表达的抗原。疟原虫雌雄配子细胞在蚊虫吸血后的数分钟内就从红细胞中释出，其细胞膜上存在的所有蛋白暴露于血餐的组分，包括抗体和补体等，它们在蚊中肠中仍具活性[6]。P48/45和P230具特征的配子体细胞表面蛋白，抗这类抗原的抗体通过中和或凝集作用及补体介导的溶细胞作用等，抑制配子融合受精和合子形成。另一类是配子进入蚊中肠后表达的表面抗原及受精后合子和动合子的表面抗原。蚊中肠环境触发了此期疟原虫相关抗原的表达，包括细胞质中存储的表面蛋白mRNA的翻译，如P25[7]。与P230和P48/45不同，这些疟原虫有性阶段特异性蛋白不会暴露于人类宿主的免疫系统，因此，预计不会自然获得抗体，但可以通过疫苗接种诱导。靶向这些有性阶段疟原虫表面抗原的抗体可抑制或阻断蚊内疟原虫生活史周期的完成，从而减少甚至阻断传播[8]。此外靶向蚊中肠抗原的抗体，如抗按蚊氨基肽酶N(Anopheline alanyl aminopeptidase N,AnAPN1)、羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)和纤维蛋白原相关蛋白1(fibrinogen-related protein 1,FREP1)的抗体，可显著减少恶性疟原虫和间日疟原虫在蚊中肠的卵囊数[9,10,11]。
针对人体内配子体形成全过程，表达在红细胞表面的配子体蛋白可能是另一类传播阻断靶抗原[12]。红细胞内无性阶段疟原虫向其表面输出蛋白质，但红细胞表面配子体特异性蛋白的研究结论仍不明确，预示着鉴定新型候选疫苗的机会。
1.1 P48/45
P48/45属于6-半胱氨酸(6-Cys)蛋白家族，通过糖磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定于疟原虫配子体及配子细胞表面，与P230形成稳定的复合物，在雄配子的受精过程中发挥重要作用。最初使用配子体及配子免疫小鼠获取的传播阻断单克隆抗体识别出P48/45[13,14],来自流行区疟疾感染者的血清亦可与P48/45蛋白发生血清学反应[15]。基因敲除P48/45的恶性疟原虫和伯氏疟原虫雄配子不能粘附并穿入雌配子，导致卵囊数量的显著减少[16]。恶性疟原虫P48/45(Pfs48/45)由448个氨基酸组成，分子质量约为51 ku, 其特异性单克隆抗体在标准膜饲实验(standard membrane feeding assay, SMFA)中表现出传播阻断效应，以MAb45.1效能最强[17],与其他候选抗原的单克隆抗体相比，实现完全阻断的所需抗体浓度最低。Pfs48/45可以引发特异性免疫反应，来自免疫动物的血清可阻断疟原虫蚊体内的发育过程[8]。从自然感染人体内提取的抗pfs48/45的抗体亦具有传播阻断功能[18],且血清中抗pfs48/45抗体滴度与疟疾传播阻断效能呈正相关[19],表明P48/45可以激发人体的特异性体液免疫反应，并可通过再次接种或感染而加强免疫，是传播阻断疫苗研发的潜力抗原[18]。P48/45疫苗的研制一直受限在正确空间结构蛋白的表达上，P48/45含有3个结构域，每个结构域都含有保守的半胱氨酸(图2),不适合的糖基化和不正确的二硫键使表达的蛋白不具有有效的传播阻断抗原表位。而利用单克隆抗体识别出最具传播阻断效应的位于C端10-半胱氨酸结构域(10C)内的抗原表位Ⅰ[20],在一定程度上推进了P48/45疫苗的研制。乳酸球菌的表达体系在Pfs48/45重组亚单位疫苗的表达上做出了很大的突破，并将10C截短为含有C端6个半胱氨酸的结构域(6C),在不破坏抗原表位Ⅰ的同时增加表达量。研究者是将Pfs48/45的6C与恶性疟原虫的富含谷氨酸蛋白(glutamate-rich protein, GLURP)的N端非重复区(R0)组成融合蛋白(R0.6C),使6C在表达系统内能形成正确的折叠。R0.6C易纯化获取，可被MAb45.1识别，免疫啮齿动物能引发有效的体液免疫反应，制备达到美国药品生产质量管理规范(cGMP)和临床试验的要求[21,22]。杆状病毒的表达系统亦是6C表达的可选方案，其可表达出大小、电荷、构象、二硫键均正确的无糖基化非融合蛋白[23]。全长的Pfs48/45还可在昆虫细胞(果蝇S2细胞)内被正确折叠的高产量表达，免疫小鼠可获得传播阻断抗体[24]。
间日疟原虫红内期的体外培养仍不成熟，不易获取配子体，在一定程度上限制了间日疟原虫TBVs的研究与评估。Pvs48/45重组蛋白的表达与Pfs48/45一样，具有挑战。使用含有Pvs48/45全长的DNA疫苗可以克服蛋白折叠的问题，诱导的抗体能够减少蚊中肠卵囊数量[25]。除此之外，使用大肠埃希菌和中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞表达的重组Pvs48/45均可在小鼠体内诱导传播阻断型抗体，并以CHO细胞表达的重组Pvs48/45配伍由矿物油和甘露醇单油酸盐家族表面活性剂组成的油包水佐剂Montanide ISA-51表现出最佳的实验结果，抗体滴度高维持时间长[26]。目前，基于Pvs48/45 C末端6-Cys结构域的疫苗研究鲜有报道。
1.2 P230
P230也属于6-Cys结构域蛋白家族，通过与P48/45的相互作用保留在疟原虫细胞膜表面，对雄性配子体出丝中心的形成至关重要。恶性疟原虫P230(Pfs230)含有3135个氨基酸的蛋白质，分子质量约363 ku, 当配子从红细胞释出时，其前端的442个氨基酸区段被切除，截短至300 ku[27]。Pfs230最初与Pfs48/45一同被识别出来，自然感染的患者血清亦可与其发生血清学反应。Pfs48/45基因敲除后，Pfs230的生成不受影响，但不能定位在配子表面。Pfs230基因敲除后，雄配子体仍可以出丝，但不能结合未感染的红细胞形成出丝中心，感染蚊虫后卵囊的形成数量明显减少[28]。Pfs230包含14个6-Cys结构域，每个结构域包含4～6个半胱氨酸残基(图2),这些众多的半胱氨酸残基使得表达正确折叠的可溶性全长蛋白质极具困难。Williamson等表达的含有氨基酸443-1132区段的麦芽糖结合蛋白融合抗原可免疫小鼠产生传播阻断型抗体[29],此区段包含蛋白酶切后的N端非6-Cys结构域区段和前3个6-Cys结构域。此后，Pfs230443-1132aa的相关区段已在毕赤酵母、无细胞麦胚芽表达系统、植物及杆状病毒等表达系统获得成功表达[30]。重组表达的N端首位6-Cys结构域抗原Pfs230D1M(542-736 aa)也能免疫动物诱导传播阻断型抗体，展现出后续疫苗研发的价值[31]。并且使用具有传播阻断效应的抗体鉴定出Pfs230的功能性抗原表位主要位于氨基酸443-730区域[32]。毕氏酵母表达的Pfs230D1M与铜绿假单胞菌去毒的外毒素A(Exoprotein A,EPA)偶联，可制备成生物纳米颗粒，增加靶抗原的免疫原性，并且配伍佐剂铝胶(Alhydrogel)的疫苗制剂已完成了Ⅰ期临床试验(NCT02334462),因其含有补体参与的传播阻断效能，阻断效果优于Pfs25[33]。Pfs230D1M-EPA配伍脂质体佐剂AS01的Ⅰ期临床试验刚刚完成，相比配伍佐剂Alhydrogel, 可诱导更高的抗体滴度，维持的时间亦更长(NCT02942277),现已准备在马里开展2期临床试验(NCT03917654)。Pfs230D1M-EPA配伍基于皂苷的佐剂Matrix-M的疫苗制剂正在开展Ⅰ期临床试验(NCT05135273),因Matrix-M可诱导细胞和体液免疫反应，并能延长免疫反应的持续时间[34],具有临床转化的前景。Pfs230D1M与脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白复合物(Outer Membrane Protein Complex, OMPC)偶联后，免疫原性也可被加强，与偶联EPA相比，诱导的抗体水平更高，其中较高水平的IgG2将更有利于发挥补体的功能[35]。
间日疟原虫的Pvs230是Pfs230的同源蛋白质，含有结构域Ⅰ～Ⅳ(CRDI-IV)的DNA疫苗免疫小鼠可以诱导传播阻断型抗体，免疫血清可显著减少蚊中肠卵囊的数量，并且不依赖补体[36]。Pfs230D1M的同源区Pvs230 D1M已在毕赤酵母中成功表达，并可被间日疟原虫感染者的血清识别[37],但其免疫动物获取抗体的传播阻断实验和利用它亲和纯化感染者血清抗Pvs230抗体进行阻断效果评价的实验尚未开展。
1.3 P47
P47也属于6-Cys结构域蛋白家族，其基因与P48/45基因旁系同源，亦是GPI锚定蛋白，定位在疟原虫雌配子体、雌配子、合子和动合子表面[38]。P47可介导伯氏疟原虫和恶性疟原虫在蚊体内的免疫逃逸[39]。蚊中肠上皮细胞在动合子入侵时造成其不可逆损伤，激活JNK(c-Jun N-terminal Kinases)途径调节的两步硝化反应，继而激发蚊血细胞微囊泡释放，活化蚊补体样系统。含硫脂蛋白1(thioester-containing protein 1,TEP1)是脊椎动物补体C3因子的同系物，存在于血淋巴中，为蚊补体样系统的关键因子，与动合子表面结合后触发形成复合体，最终杀死疟原虫[40]。恶性疟原虫P47(Pfs47)可干扰动合子入侵时中肠细胞的JNK信号，抑制硝化反应和后续TEP-1介导的杀伤作用[41,42]。P47对伯氏疟原虫雌配子受精也起重要作用[43],但恶性疟原虫其基因敲除后并不影响受精[38],这点功能的不同可能与有限的保守序列有关。Pfs47具有信号肽、GPI锚定序列和3个6-Cys结构域，其中第2个结构域是仅含2个半胱氨酸的退化结构域(图 2)。大肠埃希菌硫氧还蛋白融合表达系统表达的可溶性Pfs47融合蛋白(T-Pfs47)具有免疫原性，但用其获得的多克隆抗体和单克隆抗体均未表现出传播阻断的效能，Pfs47全长抗原诱导的抗体主要靶向第1和3结构域，而靶向第2结构域中央区段抗原(178-229aa)的抗体表现出显著的阻断传播效能[44]。Pfs47具有显著的地理结构差异，这与蚊体内免疫压力下的自然选择和疟原虫适应不同区域相应蚊媒宿主一致[40],但是最具候选疫苗价值的52个氨基酸的抗原区段相对保守，现有7个不同的单倍体型，氨基酸序列同源性在96%-98%[44]。在间日疟原虫方面，基于Pvs47的DNA疫苗免疫小鼠后的血清可以识别天然构象蛋白质，免疫血清可以减少蚊中肠卵囊数量，并且Pvs47在来自3个地区的27株间日疟原虫分离株中表现出有限的氨基酸多态性[25]。P47 对疟疾传播的重要性值得进一步研究，明确它的受体和破坏JNK 信号的机制，评估其作为阻断疟疾传播目标的可行性。
1.4 P25
P25属于P25蛋白家族，具有4个串联的表皮生长因子样结构域，N端含有信号肽，C端含有GPI锚定序列(图2),其雌配子体内的转录本主要在合子、动合子阶段翻译，蛋白表达在成熟的动合子时达峰值，并直到卵囊时期[13]。它可以与蚊中肠上皮细胞层粘连蛋白结合，形成受体/配体复合物，调节疟原虫的发育[45]。其可能还具有保护疟原虫免受蚊中肠蛋白水解酶和蚊免疫系统伤害的作用，并对动合子穿过蚊中肠上皮及动合子向卵囊的转化具有重要作用[46]。基因敲除伯氏疟原虫P25基因可部分抑制斯氏按蚊的疟疾传播，而P25和P28双基因敲除几乎可完全阻断传播[47]。这些实验均表明P25对疟原虫的有性阶段发育非常重要，并且它在疟原虫人体发育期不表达，不受人体免疫压力的选择，抗原序列相对保守[48],使得其在传播阻断疫苗研究上极具吸引力并处于领先地位。自编码恶性疟原虫P25(Pfs25)的病毒载体疫苗实现成功表达正确折叠蛋白后[49],使用酵母、植物及藻类等的Pfs25和Pvs25重组表达均获成功[7,50]。但因P25较弱的免疫原性和配伍佐剂引起的受试者不良反应限制了其快速的临床转化[51]。为了克服这些问题，将EPA与P25偶联，增强免疫原性，并配伍Alhydrogel佐剂进行了Ⅰ期临床试验，结果表明Pfs25-EPA/Alhydrogel肌肉注射具有良好的耐受性和安全性，可以诱导无疟疾接触者和流行区受试者传播阻断型抗体的产生，使用免疫血清的SMFA实验观察到显著的传播阻断效能，但直接皮饲试验(direct skin feeding, DSF)未能观察到。尽管偶联了免疫原性增强因子EPA,仍需要4次疫苗接种才可获得SMFA实验表现出阻断效能的血清，且抗Pfs25的抗体滴度在免疫后迅速降低[52]。Pfs25的病毒载体疫苗(Pfs25-IMX313)和植物来源的病毒样颗粒疫苗(Pfs25 VLP-FhCMB)的Ⅰ期临床试验亦存在类似的结果，疫苗可诱导受试者产生免疫反应，但却不具有显著的传播阻断效能[53,54]。与接种Pfs25-IMX313小鼠的免疫反应比较，发现较差的CD4+T细胞免疫原性限制了人体对疟原虫传播阻断候选抗原Pfs25的体液免疫[55]。目前，配伍佐剂AS01的Pfs25M-EPA疫苗已完成Ⅰ期临床试验，鲜有结果分析的文献报道(NCT02942277),配伍佐剂Matrix-M的Pfs25-IMX313疫苗正进行Ⅰb期临床试验，将检测疫苗在疟疾流行区坦桑尼亚成人和儿童接种后的安全性、免疫原性、传播阻断效能等评价指标(NCT04271306)。对间日疟原虫Pvs25疫苗的研制遇到同样的问题，疫苗抗原免疫原性较弱，诱导的传播阻断抗体水平较低。使用酿酒酵母表达的Pvs25配伍佐剂Alhydrogel的Ⅰ期临床试验结果就表现出这样的问题[56],配伍油包水佐剂Montanide ISA 51的Ⅰ临床试验因配伍相关的严重不良反应而终止[51]。基于P25的疫苗尚需优化，进一步增加免疫原性，明确疫苗接种后的免疫反应，并同时考虑佐剂和疫苗制剂的安全性。
1.5 HAP2
HAP2/GCS1是保守的雄性特异蛋白，具有单个跨膜结构域、胞外结构域和相对较短的胞内结构域(图 2),在结构上与病毒Ⅱ类融合蛋白同源，对受精过程磷脂双分子层的融合起重要作用[57,58,59]。HAP2作为膜融合剂最初在开花植物拟南芥雄性不育的筛选中鉴定出来[58];后来在麝香百合花粉内的生殖细胞上也鉴定出此蛋白，并被命名为生殖细胞特异性蛋白1(generative cell specific 1,GCS1),在精卵融合过程必不可少[57]。HAP2高度保守，存在于单细胞原生生物、藻类、高等植物、刺胞动物和节肢动物等广泛的物种中，其分子中保守的疏水性融合环是关键的功能域[60]。在伯氏疟原虫，HAP2表达在红细胞内雄配子体和雄配子表面，Hap2敲除的疟原虫配子可以粘附，但不能进行细胞膜的融合[61]。根据HAP2融合环(PfHAP2:178-195aa, PbHAP2:174-191aa)设计并表达的融合蛋白可诱导具有传播阻断效能的抗体，并且抗PfsHAP2的免疫小鼠血清可以抑制来自自然感染供体的恶性疟原虫配子体感染蚊子[59]。HAP2融合环外的其他抗原表位也可诱导传播阻断型抗体，其中更加保守的HAP2/GSC1结构域(PFAM 10699)将是传播阻断疫苗设计的靶位点之一。使用不含融合环区段的重组PbHAP2蛋白(335-609aa)可以免疫小鼠产生抗HAP2的传播阻断型抗体，在体外有效抑制伯氏疟原虫向动合子转化，且SMFA的蚊体内卵囊数量显著减少[62]。小麦胚芽无细胞表达系统表达的重组PfHAP2(195-684aa)免疫小鼠后，获得的抗体进行SMFA,亦观察到蚊中肠卵囊数量的显著减少[63]。杆状病毒表达系统表达的含有PFAM 10699的间日疟原虫HAP2抗原(231-459aa)免疫兔后可以产生抗PvHAP2抗体，能识别血涂片中的雄配子体，直接膜饲实验(direct membrane feeding assay, DMFA)观察到阻断效能，但是在最高的抗体滴度情况下，仍不能实现完全阻断[64]。而这些对蛋白不同区段表达的抗原研究将筛选出最具优势的候选抗原表位。目前尚无开展HAP2疫苗的临床试验报告。但考虑到其在雄配子体细胞和雄配子表面的定位以及在受精过程中的重要作用，HAP2可作为TBV候选抗原开展深入研究。
1.6 AnAPN1
AnAPN1是蚊中肠表面一种高度保守的表面糖蛋白，属于金属肽酶M1家族，参与血餐的消化。不同于其他针对疟原虫表面抗原的传播阻断疫苗候选抗原，它源于蚊子，可对抗多种疟原虫的新型疟疾传播阻断疫苗候选抗原[10]。AnAPN1包含N端信号肽、4个结构域及C末端的GPI锚定序列，预测胞外区含有1黏蛋白O-糖基化区(图2)。该蛋白N末端结构域(60-195aa)具有高度保守的线性B细胞表位和CD4+T细胞表位，诱导产生的抗体可以阻止恶性疟原虫和间日疟原虫动合子穿过中肠壁并发育成卵囊，从而阻断疟原虫的进一步发育和传播[10,65]。在AnAPN1晶体结构分析的基础上，鉴定出N端结构域内的抗原肽7(98-123aa)和抗原肽9(173-194aa)两个主要的传播阻断抗原表位[66]。进一步使用甘氨酸柔性链将2个拷贝的含有抗原肽7和抗原肽9的区段连接起来，构建抗原UF6b, 并与以皂苷QS21和TLR4激动剂构成的脂质体佐剂GLA-LSQ配伍制成临床前疫苗。UF6b /GLA-LSQ对小鼠具有良好的免疫原性，诱导的抗体具有显著的传播阻断效能[67]。但应注意到，大肠埃希菌表达的全长蛋白或含有N端抗原肽的抗原区段都能诱导具有传播阻断效能的抗体，而病毒载体表达的对应区段抗原诱导的抗体却不具显著的传播阻断效能[7,68]。可能与蛋白的糖基化情况或其他的免疫显性表位遮盖了传播阻断表位有关。AnAPN1的传播阻断性抗原区段高度保守，抗AnAPN1抗体在不同的媒介按蚊体内可以跨株和种的阻断疟原虫发育[10]。因此，从靶向蚊中肠疟原虫受体蛋白的角度设计传播阻断疫苗，可以解决从疟原虫自身角度研制疫苗的局限性，具有向TBV更进一步的研发价值，目前尚未开展关于AnAPN1的临床试验。
1.7 红细胞表面的配子体蛋白
疟原虫配子体期表达的表面蛋白有望成为TBVs的抗原，包含定位在配子体细胞表面的P48/45和P230等及红细胞表面的配子体蛋白。疟原虫侵袭红细胞后寄居在纳虫泡内，分隔于红细胞胞质，配子体细胞表面蛋白在其感染的红细胞被吞噬后得到提呈。这些抗原诱导的免疫反应在人体内可能对疟原虫配子体并无影响，但在蚊中肠可作用于配子，影响蚊体内的疟原虫发育。除了关注如P48/45和P230的配子体细胞表面蛋白外，还要注意疟原虫配子体发育过程中会释放一些蛋白，它们通过纳虫泡的膜，进入红细胞胞质或细胞膜上，调整红细胞[69]。配子体的发育主要在宿主骨髓实质血管外间隙，并研究推测配子体是在成红细胞岛中的有核红细胞内发育的，成熟后释放于血液[3,70],此发育过程可能需要向有性发育的裂殖子或配子体红细胞表面疟原虫蛋白与宿主受体的粘附。通过免疫因子靶向疟原虫有性发育过程的黏附分子，可能具有抑制传播的潜能。但未成熟配子体感染的红细胞与骨髓内皮细胞在内的多种器官内皮细胞均无显著有效粘附[71],推测未成熟配子体感染红细胞的刚性或与骨髓间充质细胞粘附是未成熟配子体驻留骨髓的机制之一[72,73]。目前虽没有鉴定出红细胞表面的配子体特异性蛋白，但从早期配子体蛋白质组分析，预测有1/10输出到宿主细胞[74]。也观察到疟疾的反复感染有助宿主清除成熟配子体[75,76],并且抗成熟配子体红细胞表面未知抗原的抗体与血液低配子体负荷相关[77]。使用感染者血清可识别到早期未成熟配子体寄生的红细胞表面疟原虫抗原，它们大多也表达在无性疟原虫寄生的红细胞表面，包括SURFIN、STEVOR、RIFIN家族蛋白等，抗配子体血清可以降低包括配子体在内的疟原虫负荷，体外可以介导配子体的免疫清除，因此配子体红细胞表面疟原虫蛋白被提议作为阻断传播疫苗的靶抗原[12]。这类抗原可诱导机体免疫反应，自然感染能激发免疫记忆，在传播至蚊虫阶段前起到阻断传播的作用。并且作为疫苗的效果评价不需要膜饲实验及生态监测蚊虫疟原虫感染情况，采用简单的显微观测或依赖核酸序列的扩增技术(QT-NASBA),通过标准随机试验就可评估疫苗接种者外周血配子体携带情况[78]。考虑此类抗原的自身特性，我们应像寻求红内期疫苗抗原一样，寻求配子体期单一拷贝基因编码的红细胞表面保守蛋白，可能是制备有效传播阻断疫苗的理想候选者。
2 疟疾传播阻断免疫
2.1 人体内的传播阻断免疫
依据疟原虫配子体的发育过程，可以分为不成熟配子体和成熟配子体，它们在生物特性、形态及人体内的组织定位都有所不同，针对它们的传播阻断免疫效应亦有所不同，针对未成熟配子体，免疫效应在于阻止早期有性阶段疟原虫或早期配子体感染红细胞的粘附，在进入血液循环前清除发育中的配子体，针对成熟配子体，则在于减少循环血液内配子体数量及抑制或阻断蚊体内的发育。固有免疫和细胞免疫在一定程度上参与其中，有实验表明，吞噬细胞通过CD36与恶性疟原虫PfEMP1结合，介导Ⅰ期和Ⅱa期配子体的吞噬[79]。CD4+T细胞对配子体抗原也具有明显的反应，基于鼠疟研究发现其参与诱导持久的抗配子体免疫，并且似乎对体内疟原虫各发育阶段均有效[80]。同时疟疾感染可诱导不同的促炎性细胞因子，其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可刺激白细胞生成NO,对体内疟原虫具有杀伤作用，包括配子体[81],其免疫效应具有不受疟原虫虫种和发育阶段限制的显著优点。体液免疫对人体疟原虫有性阶段的影响仍不清楚。推测疟原虫配子体在人体内发育过程中可能在红细胞表面表达蛋白，在自然暴露的个体中引发体液免疫，减少循环血液中的配子体负荷。虽然还没有鉴定出配子体特异性红细胞表面蛋白，但部分无性体红细胞表面的疟原虫蛋白在未成熟配子体早期阶段也有表达，疟原虫感染后可产生这些抗原的抗体，并且抗体水平与疟原虫感染期间无性体和配子体的负荷负相关[12]。此外，补体也参与配子体的裂解[7]。
2.2 传播阻断免疫的蚊体内效应
抗体介导的凝集、补体的细胞毒作用和免疫细胞介导的裂解及吞噬等可能是影响蚊中肠内疟原虫有性阶段存活及发育的免疫机制[82]。人体内疟原虫配子体死亡后将被吞噬清除，其红细胞内配子体表面的蛋白被免疫系统识别，有些抗原共存于人体和蚊体的疟原虫有性细胞表面，抗体在人体内产生，效应在蚊体内显现，影响配子的形成、受精、合子的存活和动合子的侵袭，抑制甚至阻断蚊虫的感染。灭活配子体或配子的免疫实验[83]、使用间日疟原虫感染者血清进行的DMFA[84]和使用恶性疟原虫感染者血清进行的SMFA[15]等均证明了传播阻断免疫在蚊体内起效，并主要由抗体介导，通过凝集、激活补体系统、调理作用等影响疟原虫的有性生殖过程或损伤裂解疟原虫[82]。除了针对配子体表面蛋白的抗体，针对合子、动合子及蚊中肠黏膜蛋白的抗体亦具有传播阻断的效应[10,82]。只是合子、动合子期等疟原虫进入蚊中肠后开始表达的蛋白是疟原虫在人体阶段不表达的抗原，无法在自然感染时产生抗体，免疫接种后也不会因感染激发免疫记忆。蚊中肠黏膜蛋白亦存在同样的情况。除抗体外，血液内的其他组分随蚊吸血进入中肠后亦可作用于有性阶段疟原虫。吞噬细胞可能会直接吞噬从红细胞内释出的配子，体外实验表明，细胞外配子可以被吞噬细胞吞噬，并且免疫血清对其有促进作用[85]。疟疾患者外周血中的促炎性细胞因子和补体成分会升高，进入蚊中肠后抑制疟原虫配子的结合和进一步分化[6,86]。活性氮对蚊中肠内疟原虫发育也有影响。Ramiro等[87]研究表明活性氮影响伯氏疟原虫雄配子的出丝、受精和动合子的发育，去除白细胞或使用一氧化氮合酶阻滞剂可以显著减少动合子的凋亡[88]。但考虑环境的改变，温度亦不是其最佳活性的37 ℃,免疫细胞及分子在蚊中肠内的效应可能具有局限性。
2.3 抗体介导的疟疾传播效应
除了抗体介导的疟疾传播阻断效应，我们尚需关注抗体介导的传播增强现象。无论是恶性疟原虫还是间日疟原虫，来自流行区的不同感染者的血清样本，有些能够抑制蚊虫感染，有些却促进蚊虫感染[15,89]。食蟹猴疟原虫感染猕猴的纵向评估发现，抗配子体抗体滴度从基线水平稳步增加，其峰值期血清具有传播阻断效应，在感染的早期和峰值后的恢复期，抗体滴度较低时，血清起到促进传播的作用[90]。在观测6名间日疟原虫患者治疗后100 d内血清抗配子抗体的含量变化及传播阻断能力的实验中，发现传播阻断效果随抗体浓度的降低而线性下降，半衰期大约2个月，并且治疗80 d后的一名患者血清具有显著的促疟疾传播的作用[91]。在对传播阻断性血清稀释的SMFA中发现，与稀释后的抗Pvs48/45单克隆抗体类似，低浓度的抗体促使不具感染性的低密度配子体感染蚊子[92]。抗Pfs48/45和Pfs25的单克隆抗体在低浓度时也可能促进疟原虫感染蚊子[93]。抗体介导的疟疾传播机制目前尚不清楚，针对雌雄配子表面共同抗原的抗体，可能在低抗体浓度时，不能中和配子或起到调理作用，反而促进了雌雄配子结合受精。此外还有一类抗体只表现出促进传播的效应。最近在恶性疟原虫Pfs47的研究中发现针对Pfs47第2结构域中间区段的单克隆抗体具有传播阻断的效应，而靶向此结构域N端抗原肽(155-181aa; 图2)的单克隆抗体显著增加了蚊中肠卵囊数量[44],可能这一抗体的结合协助了Pfs47介导的疟原虫的蚊免疫逃逸。现对有性期疟原虫的免疫认识仍不足，而这一机制的阐明将优化疟疾传播阻断疫苗的设计与开发。
3 结语
目前人类疟疾的防控已偏离WHO全球疟疾战略的轨道，要实现2030年将全球疟疾发病率和死亡率降低90%的目标，需要新的办法、新的工具和更好的执行现有策略。安全、有效、廉价的疫苗将在抗击疟疾方面发挥关键作用，帮助疟疾防控重回正轨。TBVs可以降低流行区疟原虫的传播、防止疟疾的爆发流行、减弱或免除输入性感染者造成的流行、协助其他干预措施对抗突变株，最终将有助于消灭疟疾。传统TBVs的研究取得进展，P48/45、P230、P47等候选疫苗均摸索到了功能性抗原区段，Pfs25的疫苗率先在疟疾流行区开展临床试验，为未来TBVs的临床试验提供宝贵的参考。随人体内疟原虫配子体发育过程和传播阻断免疫的深入研究及疟原虫侵袭相关蚊源受体的发现为TBVs的研制开辟了新的途径。
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