研究小麦7OE亚基导入和揉面特性的方法
摘要：利用195份矮败小麦与津强5号杂交得到的高代品系，研究了7OE亚基在其中的分布，探讨7OE亚基材料与揉面特性之间的关系。结果表明，195份材料中有6份材料扩增出447 bp的片段，占所检测品系的3.07%。7OE亚基对小麦的揉面特性部分指标有显着的正面影响，峰值高度、8分钟带宽在有无7OE基因间变异系数差别较大，含7OE亚基材料与非7OE亚基材料在8分钟带宽这一指标达到极显着差异。7OE亚基对改良小麦品质作用较大，8分钟带宽可作为品质分析的重要指标之一，此标记特异性较好，可用于中国小麦的品质改良。
关键词：矮败小麦; Bx7OE;揉混特性;分子标记
小麦贮藏蛋白决定小麦的品质特性，决定面团的弹性和延伸性。高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)仅占小麦贮藏蛋白的10%，但对加工品质起着决定性作用。HMW-GS由染色体1A、1B、1D长臂上的位点控制，这些位点总称为GLu-1位点。不同HMW-GS亚基对面团特性和烘烤品质有着不同的影响。Glu-A1编码的1和2*亚基，Glu-B1编码的7+8、17+18、13+16和14+15亚基以及Glu-D1编码的5+10亚基均对面包加工品质有正向作用[1-2]。近年研究发现，1Bx基因的复制导致7亚基的超量表达，这可以显着提高面团强度 [6-7]。国内对7OE亚基也进行了初步研究。张平平等选用13份含7OE亚基姊妹系材料，利用反相高效液相色谱分析法(RP-HPLC)和凝胶色谱(SE-HPLC)方法研究了含Glu-B1al(7OE+8)材料的HMW-GS总量和面团强度。任妍等利用两对STS引物验证了检测7OE引物的特异性，为其快速检测提供了方法。
矮败小麦是用“矮变1号”给太谷核不育小麦授粉，F1不育株再用高秆品种测交所得，中国自主创新的重大科技成果。矮败小麦的后代群体中一半是异交结实的矮秆雄性不育株和一半自交结实的非矮秆可育株，是理想的轮回选择工具。津强5号品质达国家一级强筋小麦标准，且各项品质指标与加麦和硬红春相仿，经张平平等检测含7OE亚基。
Ragupathy 等根据LTR 逆转座子边界与重复片段的结合区域设计了两个STS 标记并检测了400 多份小麦品种，经任妍研究能有效鉴定7OE基因，这为快速准确检测7OE基因在本群体中的分布提供了可能。本研究对195份矮败小麦与津强5号杂交得到的高代品系7OE亚基进行分子检测，明确此位点等位基因的分布规律，并检测这批材料的揉混特性，为我国小麦育种提供有用的材料以及分子标记辅助选择方法。
1 材料和方法
1.1 供试材料
195份以津强5号作为轮回亲本与矮败小麦回交2次的高世代品系，2009年种植于天津市武清区周庄村，每区2行，行长2 m，行距30 cm，5 cm点播。对其中9份农艺性状优良的非7OE亚基和6份含7OE亚基材料于2010年进行进一步扩繁，分析其揉混特性。
1.2 基因组提取
采用SDS法提取小麦基因组DNA。每份材料分别提取二粒种子的DNA，利用紫外分光光度计检测DNA浓度，终浓度调整至20 ng·μL-1。
1.3 STS标记检测
利用Ragupathy等开发的显性STS标记检测Bx7OE基因。引物由天津润泰科技发展有限公司合成。
标记(重复片段与逆转座子左边结合引物)：TaBAC1215C06-F517：5‘-ACGTGTCCAAGCTTTGGTTC-3‘，
TaBAC1215C06-R964：5‘-GATTGGTGGGTGGATACAGG-3‘;
PCR反应体系为20 μL，含10×PCR Buffer 2 μL，d NTP(A、T、C、G)各200 μmol·L-1，每条引物1 μL (10 mmol·L-1)，Taq DNA聚合酶(Takara)1 U，模板DNA 50 ng。标记1的PCR反应程序为：94 ℃变性5 min;94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min。
PCR扩增产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，缓冲液体系为1×TAE溶液，180 V电压电泳30 min，溴化乙锭染色后，用Gel Doc XR System扫描成像并存入计算机。
1.4 制粉方法
采用德国Brabender senior试验磨按AACC26-21A方法制粉。
1.5 揉混特性检测
由美国National公司生产的揉混仪采用10 g揉面钵按AACC54-40A方法测试，重复2次，取平均值。
1.6 统计方法
采用DPS统计分析软件进行显着性比较。
2 结果与分析
1 Bx7OE 的STS标记检测
标记TaBAC1215C06-F517/R964 在含Bx7OE基因的材料中可扩增出一条447 bp的片段，在不含Bx7OE基因的材料中无PCR扩增产物。6份材料扩增出447 bp条带，占所检测品系的3.07%。 2 揉混特性检测
对9份田间农艺性状表现好的未带有Bx7OE品系和6份带有Bx7OE品系进行揉混图测定，图2为15份材料中2个材料的揉混特性检测，其中图2(a)为带有Bx7OE基因的材料的揉混图，图2(b)为未带有Bx7OE基因的材料的揉混图。
将9份非Bx7OE品系和6份带有Bx7OE品系的主要品质性状平均值、变幅和变异系数列于表1。由表可以看出，有与无7OE品系的峰值时间分别为4.25和3.89,变幅分别为2.79～5.47和3.3～4.81，变异系数为22.7%和14.1%，说明基因间变异系数差异较小;有与无7OE品系峰值高度的分别为63.618和70.900，变幅分别为55.898～71.947和66.929～74.111，变异系数分别为9.5%和3.9%，说明基因间变异系数差异较大;有与无7OE品系的峰值宽度分别为32.761和27.388，变幅分别为26.279～37.322和19.402～34.490，变异系数分别为13.7%和19.9%，说明基因间变异系数差异较小;有与无7OE品系的8分钟带宽分别为15.469和8.425，变幅分别为8.243～19.472和7.601～10.135，变异系数分别为26.6%和8.7%，其中有7OE品系间变异较大，无7OE品系间变异较小，说明基因间变异系数差异较大，有与无7OE品系的峰值能量分别为201.271和182.510，变幅分别为175.962～240.125和160.267～213.949，变异系数分别为为16.3%和11.9%，说明基因间变异系数差异较小。
从表2中可以看出，有7OE品系和无7OE品系间8分钟带宽呈极显着水平，含7OE品系除津09359之外，其余各材料8分钟带宽均高于13.8 min，最高达到19.472 min;不含7OE品系材料最高值为10.135 min，最低仅为7.6 min，与含7OE品系差异达到极显着差异。8分钟带宽可作为小麦揉混特性中品质评价的重要指标。
3 讨论
分子标记辅助选择因其简便准确在育种中越来越受到重视，筛选并明晰基因型和表型之间的联系有重要意义。任妍等利用RP-HPLC的结果对Ragupathy等开发的特异性STS标记进行了验证，证明此标记对Bx7OE基因的特异性，且扩增出的带型清晰、简单、准确。本研究选用此引物对195份材料进行分析，同时利用揉混仪参数对检验结果进行对应性试验。结果表明，此引物与品质相关性较高，在育种中有较大利用价值。
在本试验的检测中，含7OE亚基材料基本上均表现较强的品质特性，尤其是津09366和津09369，在后续试验中，部分重要指标远超过国家一级强筋小麦标准;但同时我们也发现，津09359材料虽然经检测含有7OE亚基，但品质数据等同甚至低于非7OE亚基材料，具体原因将在今后进行研究。
矮败小麦在冬小麦育种中发挥着巨大作用。本试验采用强筋春小麦品种津强5号，将矮败小麦田间选择着眼于春麦，获得将近200份春麦材料，构建了一个强筋矮败小麦集群，同时获得部分强筋类型春麦材料。在大田普遍表现繁育性较强、秆高大幅降低和秆强加强等偏向矮败小麦的系列农艺特征，具有较大育种价值。利用矮败小麦选育春麦材料，为春麦品种选育提供了一条新的思路。
本试验成功检测6个新品系含有7OE亚基。在先前研究中，Butow等于2003和2004年发现，在一系列澳大利亚和北美的品种中含有Bx7OE亚基[10-11]。Gianibelli等[12]在阿根廷107个优质小麦品种中检测出，有35.9%的品种含有Bx7OE亚基。此类报道也见于加拿大小麦品种Glenlea、Roblin、Bluesky及以色列小麦品系TAA36中[13]。任妍等对163份来自CIMMYT和中国的材料进行了Bx7OE亚基检测，发现仅为6.7%材料含有此基因，中国材料仅亲本含有Glenlea的3份材料和1份云南材料。我们利用此标记对我们课题已通过审定的6个津强系列品种进行检测，除津强4号外，其余均含有父本加拿大材料野猫的7OE亚基，而这些材料均具有优良的面包烘烤特性。这一方面说明提高中国小麦品质要加强外国亲本的引入，同时又说明该亚基对提升中国小麦品种育种有很大余地。
该标记可以快速准确检测小麦品种是否携带Bx7OE 基因。本研究结果可以为中国小麦育种提供有用的材料及分子标记辅助选择方法。
