探析巫山淫羊藿分蘖芽组织培养

　　对芽外植体的生长状况进行统计(表2)，以0.1% HgCl2消毒4 min的污染率最高，其次为消毒6 min，连续2次消毒(4+2) min和8 min 的污染率最低。存活率最高的为连续2次消毒(4+2) min，延长消毒时间至8 min时，污染率降低，但芽的存活率仅为50%。

　　巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S. Ying为小檗科淫羊藿属多年生宿根性草本药用植物，是我国传统补益类中药，始载于《神农本草经》，列为中品，已有2 000多年的历史，是中国应用最为广泛、最为悠久的中药之一。巫山淫羊藿的传统繁殖方式为通过地下根茎的无性繁殖及种子繁殖(有性繁殖)，种子有深休眠的特性，繁殖发芽率低，且生长缓慢[2-3]。

　　因此生产上大多采用分株繁殖的无性繁殖方式。但这些方式严格受生长季节的限制，造成繁殖系数低，限制了巫山淫羊藿的产业化和商品化生产，难以满足社会需求，同时也阻碍了遗传育种工作的开展。因此采用组织培养法繁殖巫山淫羊藿，是提高其繁殖率的有效途径，对实现淫羊藿的可持续利用具有重要意义。

　　然而，有关巫山淫羊藿组织培养研究的报道较少。本研究以巫山淫羊藿的分蘖芽为外植体，对其消毒方法，诱导、增殖及生根条件进行研究，以期对巫山淫羊藿快繁体系的建立和工厂化生产提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　供试巫山淫羊藿芽采自贵州凯里市雷山县同济堂淫羊藿GAP基地，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为巫山淫羊藿E. wushanense。

　　培养条件：基本培养基MS，WPM，B5分别附加30 g·L-1蔗糖，6 g·L-1琼脂，pH 5.8。经121 ℃，0.1 MPa高压灭菌25 min，培养温度(25±2) ℃，光强2 000 lx，光照12 h·d-1。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外植体采集及消毒 于2010年11月中旬至次年1月中旬采取生长健康的巫山淫羊藿分糵芽作为外植体，刮去芽痕，加洗洁精漂洗30 min，流水冲洗0.5 h后移至超净工作台，75%乙醇浸泡30 s，然后用0.1% HgCl2溶液分别消毒4，6，(4+2)(先用0.1% HgCl2消毒4 min，冲洗干净，剥去外层保护层，再在0.1% HgCl2中浸泡2 min)，8 min，之后用无菌水冲洗5——6次，吸干水分，取出芽尖组织接入MS培养基，每处理共10瓶，每瓶接2个外植体。20 d后观察并记录外植体的污染及生长情况，统计污染率、存活率。

　　1.2.2 不定芽诱导 将巫山淫羊藿的分蘖芽接种于含有基本培养基MS，B5，WPM及不同浓度生长调节物质6-BA，NAA，GA3的培养基中诱导不定芽，并分别添加0.05%活性炭。每个处理接种45个外植体，重复3次。试验选用L9(34)正交表做有重复的4因素3水平正交试验(表1)。外植体接种后，观察芽的萌发及生长状况，统计诱导率。

　　表1 巫山淫羊藿芽诱导的激素水平

　　Table 1 The level and factor of hormones for bud induction in vitro flower bud of Epimedium wushanense

　　1.2.3 不定芽增殖 将诱导的不定芽切下转入WPM培养基附加不同质量浓度的6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)和NAA(0.1，0.5 mg·L-1)组合的培养基上进行增殖培养。每处理接种30个芽，重复3次，1个月后统计增殖系数。

　　1.2.4 生根培养 选择有3——5片小叶，高3 cm左右的无根苗，将其切下接种于1/2 MS附加IBA(0.1，0.5，1.0 mg·L-1)，NAA(0.1，0.5，1.0 mg·L-1)，蔗糖30 g·L-1，琼脂6 g·L-1以及0.05%活性炭的生根培养基中，1个月后统计生根数，根长及苗高，计算生根率。

　　1.2.5 数据统计 实验数据采用SPSS 19.0软件进行方差分析，同时用LSD法对每因素各水平之间进行多重比较。

　　污染率=污染的外植体数/接种外植体总数×100%

　　存活率=存活的外植体/接种外植体总数×100%

　　诱导率=产生不定芽的外植体数/存活外植体总数×100%

　　增殖系数=继代后新萌发的芽苗总数/继代芽苗总数

　　生根率=生根的试管苗数/接种试管苗总数×100%

　　2 结果与分析

　　2.1 不同消毒时间对接种污染的影响

　　由此可见，随着升汞消毒时间的延长，芽的污染率降低，但同时其死亡率升高。另外0.1% HgCl2溶液1次性消毒6 min和连续2次消毒相同时间(4+2) min相比，连续2次消毒的存活率明显高于1次消毒，且污染率低于1次消毒。因此，采用 0.1% HgCl2溶液连续2次消毒(4+2) min 消毒较为适宜。