探析蒌叶提取物抗氧化抑菌活性
摘 要：蒌叶(Piper betle Linn.)别名蒟酱、青蒟、芦子、大芦子、槟榔蒟、槟榔，属胡椒科胡椒属植物[1]。蒌叶在我国古代曾是有名的栽培植物和野生药用植物，以全株或茎、叶入药，味辛、微甘，温。全株及茎叶全年可采为药用。具有祛风散寒，行气化痰，消肿止痒的功效。
关键词：蒌叶,抗氧化,抑菌活性
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2011)05-0057-03
主要用于治疗风寒咳嗽，支气管哮喘，风湿骨痛，胃寒痛，妊娠水肿;外用可治皮肤湿疹，脚癣等皮肤疾病[2]。因为蒌叶的抗病抗虫性强，长期咀嚼蒌叶还有护齿作用。研究发现蒌叶的提取物对老鼠的可逆性节育有一定作用[3]。蒌叶中的主要成分是生物碱、木脂素、黄酮类[4~5]。本文采用DPPH法及连苯三酚红法对蒌叶提取物进行了抗氧化活性研究，并分别采用蒌叶的多种提取物对多种菌株进行抑菌了实验，拟观察蒌叶体外的抗氧化及抑菌效果，为中药蒌叶的开发和应用提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 材料与试剂 蒌叶(Piper betle Linn.)采自云南保山。标本经云南大学生物系马绍宾教授鉴定后保存于云南民族大学生物技术实验室。DPPH(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl二苯代苦味肼基自由基)，日本东京化成株式会社生产;连苯三酚红，LEADMAN公司生产;没食子酸，实验室自制;其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 供试菌种 藤黄球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、普通变形杆菌(Proteus mirabilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudom onasaeraginosa)、佛氏痢疾杆菌(Valsalva dysentery bacillus)购置于云南大学微生物实验室以牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养[6]备用。
1.2 仪器与设备(只标注主要的) 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;循环水式真空水泵，河南巩义市英峪华仪器厂;7200型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;恒温箱，上海实验仪器厂;手提式压力蒸汽灭菌锅，广州市化南医疗器械厂;超净工作台，苏州净化集团安泰设备公司。
1.3 方法
1.3.1 蒌叶提取物浸膏的制备 称取晒干切碎的蒌叶茎、叶和果实各100 g，分别用95%的酒精和70%的丙酮直接回流3 h，重复4次，馏分用旋转蒸发器减压浓缩，蒸干溶剂，得膏状提取物，称重。置于小瓶子中保存备用。
1.3.2 蒌叶提取物的抑菌活性研究 取蒌叶的各种提取物0.1 g，各加入1 mL 95%的乙醇使其完全溶解，得浓度为10%的溶液，再依次稀释为5%、2.5%的浓度梯度。灭菌后放置备用。利用滤纸片琼脂扩散法[7~8]对蒌叶提取物进行抑菌活性测定。
1.3.3 蒌叶提取物的抗氧化活性研究 取蒌叶各种提取物按质量浓度均为1.05 g/L配制成抗氧化剂溶液。按以下方法进行抗氧化活性研究。
1.3.3.1 DPPH自由基捕获分光光度法[9] 往10mL 比色管中依次加入4mL pH 6.88 标准磷酸盐缓冲溶液，4 mL 0.177 7 mmol/L DPPH 溶液，混匀，再加入一定量抗氧剂溶液，蒸馏水补充体积至10mL 刻度，充分混匀，10 min 后在520 nm 处测量吸光度。对DPPH 自由基的清除率的计算
KP(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100
式中：Ai=加抗氧剂反应后DPPH 溶液吸光度;Aj=不加DPPH，只加抗氧剂及水的溶液的吸光度;Ac=未加抗氧剂，只加DPPH 及水的溶液的吸光度。
1.3.3.2 连苯三酚红褪色光度法[9] 往10mL 具塞比色管中，依次加入2mL pH 9.1 的Na2CO3—NaHCO3缓冲溶液，0.7mL 0.003 8 mol/L EDTA-Fe2 + 溶液，3.5mL 0.0001 mol/L连苯三酚红溶液，0.7mL 体积分数0.6 % H2O2溶液，蒸馏水补充至刻度后在25 ℃保温反应30 min(上面每加一次均需摇匀)，测544 nm处的吸光度。设不加H2O2时的吸光度为A0，加入H2O2 后的吸光度为Ab，则羟自由基产生量可用ΔA = A0-Ab 来表征。在体系中加H2O2之前加入一定量的抗氧剂样品，测定其吸光度As。则抗羟自由基氧化率S的计算
SP(%)=(As-Ab)/(A0-Ab)×100
2 结果与分析
2.1 蒌叶提取物对6种病原菌的抑菌活性 见表1。
注：滤纸直径为1.0 cm
由表1可知，萎叶提取物对藤黄球菌，普通变形杆菌的抑菌效果较明显，而对绿脓杆菌的抑菌效果相对较差;抑菌效果与浓度呈正相关系;不同溶剂提取物对各种病原菌的抑菌程度存在差异，乙醇提取物比丙酮提物的抑菌效果好;蒌叶不同部位的抑菌活性不一样，蒌叶果实部分的抑菌活性相对较强。
2.2 蒌叶提取物抗氧化活性测定
2.2.1 DPPH自由基捕获分光光度法研究 按实验方法加入不同体积的DPPH(质量浓度均为1.05 g/L)，测出 Ai，Aj，Ac，计算出Ai-Aj 值，据此再计算出其相应的自由基清除率K。结果见图1。
2.2.2 连苯三酚红褪色法对羟自由基的研究 按实验方法加入不同体积的抗氧剂(质量浓度均为1.05 g/L，测出 As，Ab，A0，计算出(As–Ab)/(A0–Ab)值，据此再计算出其相应的抗羟自由基氧化率。结果见图2。
1.蒌叶叶子95%乙醇提取物;2.没食子酸;3.蒌叶果实95%
乙醇提取物;4.蒌叶叶子70%丙酮提取物;5.蒌叶果实70%
丙酮提取物;6.蒌叶茎95%乙醇提取物
从图1、2 可知：随着抗氧剂用量的增加，其捕获的DPPH自由基和羟自由基也越多，抑制率上升，逐渐达到饱和状态。所做的各抗氧化剂样品捕捉DPPH自由基和羟自由基的能力次序为：蒌叶的叶子提取物>蒌叶果实提取物>蒌叶茎提取物乙醇提取物 >丙酮提取物。
蒌叶果实乙醇提取物对DPPH 自由基有很强的清除作用。其IC50比茶叶的抗氧化性略高[10]。由于身体在生命活动的氧化代谢过程中会不断产生各种自由基，对人体造成不同程度的损害，导致疾病的发生。而人工合成的抗氧化剂具有一定的毒害作用[11]，所以研究天然的抗氧化剂已成为必然要求。
3 结论
采用DPPH自由基捕获法和联苯三酚红褪色法对蒌叶的各种提取物进行了抗氧化研究结果表明蒌叶叶子部分乙醇提取物具有较强的抗氧化活性;采用滤纸片琼脂扩散法进行抗菌研究，结果表明蒌叶果实部分乙醇提取物具有更强的抗菌作用。蒌叶物质资源丰富，有很大的发展潜力，这对于研究蒌叶提取物在食品及医药行业的应用具有重要的意义，有望开发成为天然防腐剂及药物。
参考文献：
[1]中国科学院昆明植物研究所.云南植物志[M].北京：科学出版社，1986.
[2]中国药学会.第七届全国中药和天然药物学术研讨会论文集[C].1987：357~359.
[3]Nabasree Dasgupta，Bratati De.Antioxidant activity of Piper betle L.
leaf extract in vitro[J].Food Chemistry，2004，(88)：219~224.
[4]黄相中，尹燕，黄文全，等.蒌叶茎中生物碱和木脂素类化学成分研究[J].中国中药杂志，2010，35(17)：2285~2287.
[5]尹燕，黄相中，王炯，等.蒌叶的化学成分研究[J].中药材，2009，32(6)：887.
[6]黄秀梨.微生物实验指导[M].北京：高等教育出版社，1997.
[7]Ma W，Huang Y，Lin L，et a1.Two new biologically active illudane sesquterpenes from the mycelial cultures of Patmeolus retirugis[J].J An tibiot，2004，57(11)：721~725.
[8]顾仁勇，张丽，傅伟昌，等.芭蕉汁的抑菌作用[J].食品与发酵工业，2005，31(3)：57~59.
[9]郭亚力，李 聪.三种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测[J].分析试验室，2004，23(10)：43~47.
下一篇：用主成分法将中药蛇胆分类的技巧
