研究天麻基因组DNA的提取方法
作者：admin 来源：未知 日期：2020-04-09 08:12人气：
摘要：以天麻块茎为供试材料，采用琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度含量测定技术，比较改良CTAB法和SDS-CTAB法提取天麻块茎基因组DNA的效果。结果表明，改良CTAB法提取天麻块茎基因组DNA的产量高于SDS-CTAB法，纯度略次于SDS-CTAB法，二者提取的基因组DNA,DNA结构完整、大片段的DNA分子含量高。该研究为天麻基因组DNA提取方法的选择提供了参考依据，为天麻种质资源的分子遗传研究奠定了一定的科学与技术基础。
关键词：天麻； 基因组DNA; SDS-CTAB法； 改良CTAB法；
天麻为常用名贵中药，是兰科植物天麻（Gastrodia elata B1.）的茎块，植株生长于海拔400~3 200 m的林下、林中空地、林边缘及灌丛边缘，为国家二级保护植物。其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癫痫抽搐等症，同时还具有刺激神经系统、健脑、延缓衰老、增强机体免疫力和预防骨质疏松等作用[1,2].因天麻特殊的生物学特性--没有一般植物所具有的叶片，加上含丰富的蛋白质、较高的多糖和酚类、酶类及其他次生代谢物，使得其基因组DNA的提取比较困难。传统的提取方法常常导致基因组DNA产量过低、杂质较多、DNA不纯、质量较难控制等许多问题，提取物仅可满足普通的分子生物学试验分析的需要，因此众多学者对中药材基因组DNA提取方法进行过探讨[3,4,5].关萍等[6] 对天麻基因组 DNA 提取方法进行了比较研究，认为SDS-CTAB 法是较理想的提取方法；张弦等[7]证明SDS-CTAB法提取DNA完整、纯度高、重复性好；程纪伦等[8]应用CTAB 法和改良的CTAB法提取天麻基因组 DNA,结果表明改良 CTAB 法提取的天麻基因组 DNA 产量高、纯度高。但是，提取天麻基因组DNA究竟采用改良 CTAB 法效果好还是SDS-CTAB法好，还有待考证。基于天麻基因组DNA提取方法的研究现状，笔者将应用改良 CTAB 法和SDS-CTAB法对天麻基因组DNA提取效果进行比较研究。
1 材料与方法
1.1 材料
供试天麻为采集于湖北、陕西等地区的新鲜天麻，由湖南省博世康中医药有限公司提供。
1.2 主要试剂
1.2.1 改良CTAB法主要试剂。
CTAB,氯仿∶异戊醇（24∶1），RNase A,异丙醇，无水乙醇，TE.
1.2.2 SDS-CTAB法主要试剂。
β-巯基乙醇，蛋白酶K,SDS, CTAB,氯仿∶异戊醇（24∶1），RNase A,NaAc,无水乙醇， TE.
1.3 方法
1.3.1 改良CTAB法。
取天麻细小块状物约0.5 g放入研钵中，加入1 mL预热的 CTAB提取液，研磨；将细粉末转移到1.5 mL的Eppendorf管中，再加CTAB提取液至1.5 mL,置于65 ℃水浴中保温1 h;从水浴中取出离心管，冷却至室温，再12 000 r/min离心10 min,然后吸取上清液放至另一干净已灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，同时加入同样体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），轻缓颠倒混匀，12 000 r/min离心5 min,然后吸取上清液放至另一干净已灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，同时加入同样体积的异丙醇，混匀，放置在-20 ℃冰箱中60 min;12 000 r/min离心15 min获得DNA沉淀，70%乙醇洗2次，沉淀自然干燥；加入30 μL TE缓冲液或者去离子水（含有10 μg/mL RNase A）溶解DNA,并贮存在4 ℃冰箱中。
1.3.2 SDS-CTAB法。
将1.5 mL的Eppendorf管中装70 μL β-巯基乙醇，置于-20 ℃冰箱中预冷，取天麻细小块状物约0.5 g,置于预冷的离心管中，同时快速加入40 μL 10 mg/mL蛋白酶K,混合；加入56 ℃预热SDS 700 μL,混匀， 56 ℃水浴120 min,然后取出，冷却至室温，加入1/2体积100 g/L CTAB,56 ℃水浴30 min,取出，冷却至室温，再12 000 r/min离心10 min,然后吸取上清液放至另一干净已灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，同时加入同样体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），混合30 min,12 000 r/min离心12 min,取上清液重复操作一次。取上清液至另一无菌Eppendorf管中，加入-20 ℃预冷的1/10体积3 mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，置-20 ℃冰箱中沉淀60 min,12 000 r/min离心10 min.用70%冷乙醇洗涤沉淀2次，每次12 000 r/min离心10 min,沉淀自然干燥；加入30 μL TE缓冲液或者去离子水（含有10 μg/mL RNase A）溶解DNA,并贮存在4 ℃冰箱中。
1.4 基因组DNA的电泳检测
1.4.1 配制1%琼脂糖凝胶。
用电子天平称取琼脂糖粉1 000 mg,置于锥形瓶中，加入1×TBE溶液100 mL,充分摇匀，将该锥形瓶直接加热至TBE溶液沸腾，煮沸20 s,视觉判断琼脂糖粉完全溶解，取出加入一滴EB（约20 μL），缓慢摇匀后，自然降温至55 ℃左右（以不烫手背为宜）。然后，放置好制胶器，插好挡板，按要求在固定处放好梳子，再将溶液缓缓倒入胶槽，室温下放置1 h左右，待凝胶冷却凝固后，轻轻移去梳子，去掉挡板，将凝胶板置于含有TBE缓冲液的水平电泳槽中。
1.4.2 上样。
取2 μL上述2种方法提取的DNA混入少量的溴酚蓝（大约是样品量的1/10），混匀后全部点入梳子孔内，注意留出第一孔位置加入等量的DNA分子量标记。
1.4.3 恒压电泳。
接通电源后，调节电压至100 V,启动电泳，恒压电泳1.5~2.0 h,根据溴酚蓝距离点样孔的位置来判断电泳进程。
1.4.4 拍照。
将凝胶从凝胶板上取下，采用凝胶成像仪拍照。
1.5 DNA的紫外检测
蛋白质的最大吸收波长为280 nm,核苷酸为 260 nm,测波长分别为 260、280 nm 时的 OD 值进行比较，分析DNA的浓度和纯度。先用2 mL双蒸水校正紫外分光光度计的零点，用微量移液器取DNA样品2 μL,加双蒸水稀释10倍并充分混匀后，全部转入专用比色皿中，分别读出其在不同波长下的OD值，然后计算DNA样品的浓度。DNA样品浓度（μg/μL）=OD260×核酸稀释浓度×50/1 000.
2 结果与分析
2.1 改良 CTAB 法提取的天麻基因组DNA产量及纯度分析
2.1.1 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。
运用改良 CTAB 法提取的天麻基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1,DNA条带亮度高，无明显杂带。
2.1.2 DNA产量及纯度分析。
该方法提取 DNA的OD260/OD280比值为 1.756,<1.8,表明 DNA 中存在少量的杂质；根据 OD260计算所提取的 DNA 浓度为 1.513 μg/μL.
2.2 SDS-CTAB 法提取的天麻基因组DNA产量及纯度分析
2.2.1 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。
运用SDS-CTAB 法提取天麻基因组DNA后，取样2 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2,DNA条带亮度好，无杂带。
Fig.1 The results of genomic DNA electrophoresis of Gastrodia elata extracted by improved CTAB
注：M为分子量标记，1~10为提取的基因组DNA
Note:M is the molecular weight marker;1-10 are the extracted genomic DNA
Fig.2 The results of genomic DNA electrophoresis of Gastrodia elata extracted by SDS-CTAB
注：M为分子量标记，1~10为提取的基因组DNA
Note:M is the molecular weight marker;1-10 are the extracted genomic DNA
2.2.2 DNA产量及纯度分析。
该法提取 DNA的OD260/OD280比值为1.822,接近1.80,表明 DNA纯度比较高，污染比较少；根据 OD260计算所提取的天麻基因组 DNA 浓度为 1.296 μg/μL.
3 讨论
2种方法提取的天麻基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，改良 CTAB 法的条带亮度明显优于SDS-CTAB法。SDS-CTAB法使用了β-巯基乙醇、蛋白酶K、SDS,这些试剂的共同作用均可分解蛋白质，便于DNA解离，但是β-巯基乙醇为高毒试剂，且气味难闻。SDS-CTAB法耗时较改良 CTAB 法长，操作步骤较多，操作过程难免造成DNA损失。因此，SDS-CTAB法得到的DNA纯度比改良 CTAB 法高，产量比改良 CTAB 法低。
天麻块茎多糖类和酚类物质的含量相当高，在试验中有效筛选和改进不同的基因组DNA的提取方法对获得高质量的基因组DNA十分重要，也是对天麻物种进行分子生物学研究的重要前提[9].通过改良CTAB法和SDS-CTAB法提取天麻基因组DNA的比较研究表明，改良CTAB法提取天麻块茎基因组DNA的产量优于SDS-CTAB法，虽然改良CTAB法提取的DNA纯度略差，但是二者提取的 DNA 片段完整无断裂，主要原因是2种方法都使用了CTAB,CTAB具有从大量产生黏多糖的有机体中制备纯化DNA的特性。CTAB属于一种带阳离子的表面活性剂，具有较好的化学特性，即在溶液中离子强度低的情况下，可以沉淀核酸和酸性多聚糖，在溶液中离子强度高的情况下，CTAB与蛋白质和非酸性多聚糖形成复合物而不能沉淀DNA和RNA[10].提取基因DNA必须考虑后续的分子生物学研究，倾向于选择无杂质且DNA 片段完整的提取方法。
在天麻块茎基因组DNA提取过程中务必始终注意以下几点：①研钵、吸头、配制的试剂要按照要求进行灭菌，运用SDS-CTAB法时，研钵和部分试剂要在低温冰箱中预冷，尽可能地减少外来污染和DNA 降解；②研磨材料的力度应该适当，太小造成细胞破裂不充分，影响DNA得率，过大可能损坏DNA分子，所以在整个研磨过程中，应该保持用力均匀且方向一致；③操作过程避免剧烈振荡，以减少DNA断裂，动作尽量温和，保持DNA完整；④操作要规范，在制备琼脂糖凝胶时要避免产生气泡，上样电泳时移液器吸头不能插入胶中或划破胶孔，电泳时先高电压再低电压；⑤紫外分光光度计测定 DNA 样品时，使用TE 缓冲液作为溶解 DNA 的溶液比较好，是由于TE 缓冲液保持了低离子浓度，可以保证读数准确。
参考文献
[1] 袁崇文。中国天麻[M].贵阳：贵州科技出版社，2002.
[2] 周铉，杨兴华，梁汉兴，等。天麻形态学[M].北京：科学出版社，1987.
[3] 徐昌艳，雷丹丹，曹旭林，等。天冬药材基因组DNA提取方法研究[J].安徽农业科学，2019,47（8）：171-173.
[4] 方强强，王燕。岩陀DNA提取方法研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2019,40（2）：19-24.
[5] 陈力群，谭晴晴，陈雪燕，等。桑黄基因组DNA提取方法优化及分子鉴定[J].山东农业科学，2019,51（1）：18-21,31.
[6] 关萍，康冀川，邹容，等。兰科植物天麻基因组 DNA 提取方法的比较研究[J].山地农业生物学报，2004,23（5）：422-425.
[7] 张弦，张小蕾。天麻基因组DNA提取方法的选择和优化[J].吉林医学，2010,31（9）：1219.
[8] 程纪伦，范爱辉，陈琦。高质量天麻基因组 DNA 的提取[J].广东农业科学，2009（8）：153-155.
[9] 陈宗礼，陈昱宇，王睿婷，等。组培枣苗基因组DNA提取方法及其含量的比较[J].基因组学与应用生物学，2011,30（1）：110-116.
[10] 魏群。分子生物学试验指导 [M].北京：高等教育出版社，1999.
上一篇：临床医学教学标准化建设方案
下一篇：药用植物何首乌人工栽培技术策略
下一篇：药用植物何首乌人工栽培技术策略
