miR-140-5p靶向调控VEGFA参与卵巢癌血管生成的作用机制
作者：admin 来源：未知 日期：2021-03-08 08:35人气：
摘 要：
目的:探究miR-140-5p靶向调控VEGFA基因参与卵巢癌血管生成的作用机制。方法:采集实验组织标本和细胞系,qRT-PCR检测组织和细胞中miR-140-5p和VEGFA的表达水平。Western blot检测VEGFA及血管生成相关因子STAT3、HIF-1α和bFGF的表达。应用流式细胞术检测转染细胞凋亡情况。结果:卵巢癌组织和细胞中miR-140-5p低表达,VEGFA为高表达(均P<0.05)。荧光素酶报告法确认VEGFA为miR-140-5p靶点。上调miR-140-5p表达,可降低卵巢癌细胞株CAOV3中VEGFA表达,下调miR-140-5p表达,可诱导VEGFA表达(均P<0.05)。与mimic NC+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组miR-140-5p表达量增加(P<0.05),而VEGFA mRNA和蛋白表达量变化未达明显统计学差异(均P>0.05);与miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组miR-140-5p表达量显著增加，VEGFA的mRNA表达量显著下降(P <0.05)，且STAT3、HIF-1α、b FGF mRNA和蛋白表达量均显著下降(均P <0.05)。同时，与mimic NC+VEGFA-NC组和miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组相比，miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组细胞凋亡率明显增加，差异有显著统计学意义(P <0.05)。结论:miR-140-5p在卵巢癌中低表达，VEGFA高表达，miR-140-5p能特异结合VEGFA基因;上调miR-140-5p表达靶向下调VEGFA表达可降低卵巢癌血管生成相关因子表达并诱导癌细胞凋亡，为卵巢癌分子靶向治疗提供生物学证据。
关键词：
miR-140-5p VEGFA 卵巢癌 血管生成 细胞凋亡
Mechanism of microRNA-140-5p in angiogenesis of ovarian cancer by targeting the regulation of VEGFA
YAN Zhen FU Xiaorui LI Xinmin CUI Jun
Department of Obstetrics and Gynecology,Women & Infants Hospital of Zhengzhou; Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Pathology Department,Women & Infants Hospital of Zhengzhou;
Abstract：
Objective:To explore the mechanism of miR-140-5 p targeting the regulation of vascular endothelial growth factor A(VEGFA) gene in ovarian cancer angiogenesis.Methods:After collecting experimental tissue specimens and cell lines,the expression levels of miR-140-5 p and VEGFA in tissues and cells were detected by qRT-PCR,followed by the detection of the expression of VEGFA,as well as other angiogenesis related factors STAT3,HIF-1α and bFGF by Western blot,and the evaluation of the apoptosis of transfected cells by flow cytometry.Results:The expression of miR-140-5 p was low in ovarian cancer tissues and cells,while the expression of VEGFA was high(All P<0.05).Luciferase reporter assay confirmed that VEGFA was a target of miR-140-5 p.Up-regulation of the expression of miR-140-5 p can reduce the expression of VEGFA in ovarian cancer cell line CAOV3,while down-regulation of the expression of miR-140-5 p can induce the expression of VEGFA(All P<0.05).The expression of miR-140-5 p in miR-140-5 p mimic+VEGFA-NC group increased compared with mimic NC+VEGFA-NC group(P<0.05),yet no obvious difference was found in the mRNA and protein expression of VEGFA(All P>0.05).Compared with the expression in miR-140-5 p mimic+VEGFA-NC group,the expression of miR-140-5 p increased significantly and the expression of VEGFA decreased significantly in the miR-140-5 p mimic+VEGFA-siRNA group(P<0.05),and the protein expression of STAT3,HIF-1α and bFGF were significantly decreased(All P<0.05).Meanwhile,compared with mimic NC+VEGFA-NC group and miR-140-5 p mimic+VEGFA-NC group,the apoptotic rate increased in miR-140-5 p mimic+VEGFA-siRNA group remarkably,showing statistical difference(P<0.05).Conclusion:The expression of miR-140-5 p is low in ovarian cancer,and the expression of VEGFA is high,and miR-140-5 p can specifically bind to VEGFA.Up-regulation of VEGFA expression and down-regulation of targeted expression of VEGFA can reduce the expression of angiogenesis-related factors in ovarian cancer and promote the apoptosis of ovarian cancer cells,providing biological evidence for molecular targeted therapy of ovarian cancer.
Keyword：
miR-140-5p; VEGFA; ovarian cancer; angiogenesis; cell apoptosis;
卵巢癌是一类恶性程度高、病程发展迅速、病死率高的妇科恶性肿瘤[1]。其发展是多因素导致的结果。新血管生成的临床意义在于持续为肿瘤细胞提供营养素,促进肿瘤细胞侵袭和转移[2]。血管生成已报道与人类肿瘤进程恶化密切相关,如消化道癌、肺癌、乳腺癌等[3-5]。VEGFA作为常见血管生成因子,可表达于肿瘤和正常组织。血清VEGFA被报道可在卵巢癌中呈高表达,且与肿瘤转移、组织分级、不良预后相关,而手术切除后其表达呈降低趋势[6],提示监测VEGFA水平在卵巢癌中的临床意义。鉴于VEGFA在卵巢癌中的作用,本研究结合现阶段研究过程中miRNA在恶性肿瘤中所扮演的重要角色, 采用生物学预测软件,发现 VEGFA为miR-140-5p靶基因之一。而后者与结肠癌、肝癌等肿瘤的癌细胞增殖侵袭等相关[7-8]。因此,本文特提出假设miR-140-5p靶向调控VEGFA基因可能参与卵巢癌血管生成,并进一步探究内在机制,为卵巢癌的分子靶向治疗提供生物学依据和新思路。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞系
人卵巢癌细胞株CAOV3和正常卵巢上皮细胞均购自中国科学院上海细胞所细胞库。将细胞置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中常规培养,取对数生长期细胞进行实验。
1.1.2 组织标本
收集我院2015年02月至2018年02月进行手术治疗的原发性卵巢癌组织84例(病理诊断为上皮性卵巢癌),40例正常卵巢组织(非卵巢病变治疗采集标本)。卵巢癌患者均经病理诊断证实、无既往手术、放化疗等治疗史。组织取材前,本研究已通过患者知情同意及医院伦理委员会同意。取材完成后,立即将手术新鲜组织样本放入液氮中保存,随后置于-70 ℃冰箱中保存备用。
1.1.3 主要试剂及设备
细胞转染过程中所有转染序列如mimic NC、miR-140-5p mimic、inhibitor NC、VEGFA-NC及VEGFA-siRNA均购于上海吉玛制药技术有限公司(上海,中国)。Trizol(Invitrogen公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德市,USA)。紫外/可见光分光光度计(ND-1000,Nanodrop公司,USA)。BCA试剂盒(Thermo公司,USA)。Western blot一抗和二抗(Abcam,UK)。光学显微镜(GE,USA)。Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司,USA)软件图像分析仪。
1.2 实验方法
1.2.1 荧光素酶报告实验
将人卵巢癌细胞株CAOV3置于DMEM糖培养基中培养。待 细胞密度达80%～90%, 0.25%胰酶消化传代,后置于恒温培养箱(5%CO2、37 ℃)中常规培养,取对数生长期细胞进行实验。使用生物学预测网站进行miR-140-5p靶基因分析,利用荧光素酶报告法验证VEGFA是否为miR-140-5p的直接靶基因。转染48 h后收集并裂解细胞,分别使用双荧光素酶报告系统检测试剂盒在LuminoMeter20/20荧光光度计上测定荧光素酶活性。
1.2.2 细胞分组及转染
取对数生长期的CAOV3卵巢癌细胞进行实验,依据不同转染操作和不同实验目的,将细胞进行如下分组:①构建miR-140-5p上调和下调转染组别,并分别设置对照组,探究miR-140-5p表达在卵巢癌中的作用,分组如下:mimic NC组、miR-140-5p mimic组、inhibitor NC组、miR-140-5p inhibitor组;②确认VEGFA为miR-140-5p靶基因之一,构建符合VEGFA和miR-140-5p表达趋势的组别,分组如下:mimic NC+VEGFA-NC组、miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组、miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组。
1.2.3 qRT-PCR
取转染后各组细胞,按照Trizol试剂说明书,提取总RNA。使用紫外/可见光分光光度计测量280 nm下吸光度,对总RNA的质量进行鉴定及测定浓度。用逆转录试剂盒合成cDNA,进行PCR反应扩增。PCR反应用20 μL的反应体系。 miR-140-5p以U6为内参,VEGFA mRNA以β-actin作为内参。卵巢癌组织的PCR检测同于细胞检测。
1.2.4 Western blot
取冰冻保存的卵巢癌组织或转染后各组细胞提取总蛋白,并使用BCA试剂盒测定每个样品的蛋白浓度。10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质,5%脱脂奶粉封闭1 h,TBS洗膜3次,每次10 min。将印迹膜置于一抗兔抗人多克隆抗体VEGFA、STAT3、HIF-1α、bFGF中,以β-actin为内参,4 ℃封闭孵育过夜。二抗HRP标记IgG兔多克隆抗体室温孵育后,应用光学显微镜扫描显影。使用Image Pro图像分析仪对蛋白条带进行灰度扫描,分析蛋白相对表达量。
1.2.5 流式细胞术
卵巢癌细胞转染后,采用流式细胞术检测mimic NC+VEGFA-NC、miR-140-5p mimic+VEGFA-NC、miR-140-5p mimic+ VEGFA-siRNA转染各组卵巢癌细胞凋亡情况,验证假设miR-140-5p上调表达是否可通过抑制VEGFA表达在卵巢癌细胞凋亡中发挥作用。取细胞悬液,加入Annexin V-FITC和PI,避光室温孵育。应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.3 统计学分析
应用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示。组间两两比较采用t检验。多组间比较采用单因素方差分析法。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-140-5p和VEGFA在卵巢癌组织和细胞中的表达
通过qRT-PCR检测卵巢癌组织与正常卵巢组织中miR-140-5p的表达(图1A),结果显示:卵巢癌组织中的miR-140-5p表达水平显著低于 正常卵巢上皮组织(P< 0.05)。通过qRT-PCR检测miR-140-5p在人卵巢癌细胞株CAOV3和正常卵巢上皮细胞中的表达(图1B),结果显示:与正常卵巢上皮细胞相比,miR-140-5p在人卵巢癌细胞株中呈现低表达(P<0.05),与组织中表达趋势一致,可进行下一步实验。
同时,应用qRT-PCR和Western blot检测VEGFA在卵巢癌组织和细胞中的表达(图2)。结果发现:VEGFA mRNA和蛋白表达在卵巢癌组织和人卵巢癌细胞株CAOV3中均呈高表达,显著高于正常卵巢组织和正常卵巢上皮细胞,差异具有统计学意义(均P<0.05)。
图1 miR-140-5p在卵巢癌组织和细胞中的表达
图2 VEGFA在卵巢癌组织和细胞中的表达
2.2 细胞转染后miR-140-5p与VEGFA的表达
生物学预测网站提示VEGFA基因序列与miR-140-5p序列间存在特异结合区域,VEGFA是miR-140-5p的靶基因。利用荧光素酶报告法验证VEGFA是miR-140-5p靶点(图3),实验结果显示:与NC组比较,miR-140-5p mimics转染组中野生型wt-miR-140-5p/VEGFA共转染组的荧光素酶信号下降(P<0.05);而突变型3' UTR的荧光素酶活性无明显差异(P>0.05)。
因此,我们进一步通过细胞转染实验,构建miR-140-5p mimic、mimic NC、miR-140-5p inhibitor、inhibitor NC转染组别。应用qRT-PCR检测miR-140-5p表达量,结果提示:与mimic NC组细胞相比,miR-140-5p mimic组细胞的miR-140-5p表达量显著增加(P<0.05);与inhibitor NC组细胞相比,miR-140-5p inhibitor组细胞的miR-140-5p表达量显著降低(P<0.05)。同时,qRT-PCR和Western blot检测卵巢癌细胞中VEGFA的表达,结果显示:与mimic NC组相比,miR-140-5p mimic组细胞中VEGFA的mRNA和蛋白表达量均显著降低(P<0.05);与inhibitor NC组相比,miR-140-5p inhibitor组细胞中VEGFA的mRNA和蛋白表达量均显著增加(P<0.05),结果如图4所示。
图3 VEGFA与miR-140-5p的靶向关系验证
2.3 细胞转染后miR-140-5p和VEGFA表达在卵巢癌血管生成中的作用
通过上一实验构建miR-140-5p mimic、mimic NC、miR-140-5p inhibitor、inhibitor NC转染组别明确细胞中miR-140-5p和VEGFA表达的潜在关联,本实验进一步构建卵巢癌细胞转染mimic NC+VEGFA-NC、miR-140-5p mimic+VEGFA-NC、miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组别后,qRT-PCR检测卵巢癌细胞中miR-140-5p表达量和VEGFA mRNA表达,Western blot检测卵巢癌细胞中STAT3、HIF-1α、bFGF的表达,以确认细胞转染后miR-140-5p和VEGFA表达在卵巢癌血管生成中的作用。
结果显示:与mimic NC+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组细胞中miR-140-5p表达量增加(P<0.05),而VEGFA mRNA表达量变化呈下调趋势(均P<0.05);与miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组细胞中miR-140-5p表达量显著增加,VEGFA mRNA表达量显著下降(P<0.05),且VEGFA、STAT3、HIF-1α、bFGF蛋白表达量均显著下降(均P<0.05),结果如图5所示。
2.4 细胞转染后miR-140-5p和VEGFA表达与卵巢癌细胞凋亡的相关性
流式细胞术细胞凋亡率测定结果显示:与mimic NC+VEGFA-NC组[(3.84±0.23)%]相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组[(4.12±0.37)%]凋亡率增加,但差异无统计学意义(t=2.032,P=0.057);而与mimic NC+VEGFA-NC组和miR-140-5p mimic+VEGFA-NC组相比,miR-140-5p mimic+ VEGFA-siRNA组[(67.32± 3.88)%]细胞凋亡率明显增加,差异有显著统计学意义(t=51.28,P<0.000 1)。
3 讨论
肿瘤血管生成和细胞凋亡与肿瘤生物学特性密切相关。抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗重要途径之一。基于前期大量数据文献检索,我们发现通过细胞实验探究miR-140-5p及其靶基因VEGFA与卵巢癌血管生成和细胞凋亡机制研究尚缺乏,本研究方向具有一定新颖性,可为卵巢癌分子学机制和靶向治疗提供实验依据。
miR-140-5p在卵巢癌组织中表达显著低于正常卵巢上皮组织;且卵巢癌细胞系CAOV3中的miR-140-5p表达相比正常卵巢上皮细胞亦呈下降趋势,而转染miR-140-5p mimic后,miR-140-5p的表达上升。同时,VEGFA在卵巢癌组织和卵巢癌细胞系CAOV3中的表达均显著高于正常卵巢上皮组织和正常卵巢上皮细胞,而转染VEGFA-siRNA后,VEGFA表达被抑制。上述结果表明,miR-140-5p可能通过下调VEGFA表达,从而减少卵巢癌血管生成,抑制癌症进展。为验证这一推测,本研究采用荧光素酶报告法验证miR-140-5p与VEGFA的靶向关系,结果提示VEGFA基因序列与miR-140-5p序列间存在特异结合区域;同时,荧光素酶报告法验证结果显示:与NC组比较,miR-140-5p mimics转染组中野生型wt-miR-140-5p/VEGFA共转染组的荧光素酶信号下降,而突变型3' UTR的荧光素酶活性无明显差异,说明miR-140-5p能特异结合VEGFA基因。因此,本研究展开后续研究,具 体探究miR-140-5p与 VEGFA在卵巢癌中的作用。
众所周知,微小RNA在肿瘤中的重要作用。例如ZHAI等在其研究中报道miR-140-5p可抑制Smad2和细胞自噬水平,进而降低结直肠癌干细胞存活率和侵袭性[7]。TIAN等发现miR-490-3p通过下调ABCC2的表达增强卵巢癌细胞的CDDP敏感性,提示干预miR-490-3p可能是CDDP耐药卵巢癌患者的潜在靶向治疗策略[9]。国内亦有研究证实微小RNA在恶性肿瘤中的作用,例如杜莉等人通过细胞系实验,采用RT-PCT、MTT、Western blot等实验检测转染后细胞系中相关因子表达及细胞增殖等发现,miR-140-5p抑制STMN1的表达,可抑制Hedgehog信号通路,进而抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖并促进细胞凋亡[10]。本研究发现类似上述结果,揭示在卵巢癌中miR-140-5p抑制VEGFA表达。
本研究通过细胞转染实验,构建mimic NC+VEGFA-NC、miR-140-5p mimic+VEGFA-NC、miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA转染组别,探究miR-140-5p和VEGFA与卵巢癌血管生成和细胞凋亡的关联,为卵巢癌发病机制及分子靶向治疗提供依据。实验结果发现:与miR-140-5p mimic+VEGFA-NC相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组细胞中VEGFA mRNA表达量显著下降,且VEGFA、STAT3、HIF-1α、bFGF蛋白表达量均显著下降。提示上调miR-140-5p的表达,可抑制VEGFA的表达,进而抑制相关肿瘤血管生成因子(STAT3、HIF-1α、bFGF)的表达水平。就其机制而言,VEGF在肿瘤发展过程中可通过一系列的信号转导刺激血管内皮细胞增殖,导致血管内皮通透性增加,为肿瘤细胞的生长提供营养和养分,进而促进癌症发展。这一结果的临床意义在于,血管生成抑制剂在抑制肿瘤(如肺癌、前列腺癌等)生长转移中发挥重要作用[11-12]。已有研究应用微小RNA抑制血管生成,从而达到肿瘤治疗的作用,如ANDO等人就曾在其研究中强调RNA干扰是一种新型肿瘤治疗策略,其中微小RNA作用功不可没。后者可通过抑制一系列与特定事件(如血管生成)相关的蛋白表达,进而发挥抑癌作用[13]。后期研究可进一步挖掘血管生成抑制因子,应用微小RNA干扰,探究其在卵巢癌及其它恶性肿瘤中的作用。
与此同时,与mimic NC+VEGFA-NC组细胞相比,miR-140-5p mimic+VEGFA-NC细胞组凋亡率虽增加但差异无统计学意义;而miR-140-5p mimic+VEGFA-siRNA组细胞凋亡率明显增加,提示 上调miR-140-5p表达,抑制 VEGFA表达,可显著促进卵巢癌细胞凋亡,揭示可通过靶向调节机制,逆转卵巢癌进程。正常细胞进程中,细胞凋亡是一种独特死亡方式,维持细胞内稳态发展;肿瘤微环境中,肿瘤细胞恶性增殖,细胞凋亡明显降低[14]。本研究前期确认miR-140-5p可能通过下调VEGFA表达,进一步转染证实上调miR-140-5p表达,抑制VEGFA表达逆转肿瘤细胞增殖和凋亡的失衡,促进肿瘤细胞凋亡。与本研究类似,有学者在其最新研究中报道miR-140-5p可能通过靶向VEGFA抑制磷酸化蛋白激酶B的表达,抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,提示该微小RNA可能是肺癌抗肿瘤治疗的潜在靶点[15]。
总而言之,miR-140-5p在卵巢癌中低表达,VEGFA高表达,miR-140-5p能特异结合VEGFA基因;上调miR-140-5p表达靶向下调VEGFA表达可降低卵巢癌血管生成相关因子表达并诱导癌细胞凋亡,为卵巢癌分子靶向治疗提供生物学证据。本文为微小RNA干扰靶向相关基因,抑制肿瘤血管生成和平衡肿瘤细胞生物学特性作用机制在恶性肿瘤的治疗中提供分子学证据。同时,须注意本研究在血管形成上仅通过检测肿瘤血管 生成因子(STAT3、HIF-1α、 bFGF)表达水平佐证,未来尚需采用Matrigel基质胶血管形成实验全面佐证miR-140-5p靶向VEFGA参与卵巢癌的血管形成,并有待其他学者和本研究团队进一步构建动物模型并展开临床实验,为卵巢癌和其它肿瘤的分子靶向治疗提供潜在依据。
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