补肾活血方对子宫内膜干细胞移植治疗薄型子宫内膜大鼠子宫内膜形态学的影响
作者：mac 来源：文阅期刊网 日期：2021-07-15 08:48人气：
摘 要：目的 探讨补肾活血方对子宫内膜干细胞(EDSCs)移植治疗薄型子宫内膜模型大鼠子宫内膜形态学的影响。方法 从8周龄雌性SD大鼠子宫内膜中分离提取EDSCs,采用机械分离与两步酶消法，实验选用纯度较高的第3代细胞，分别采用尾静脉(IV)和宫腔注射(IU)的方法移植到实验大鼠体内。采用宫腔灌注95%无水乙醇及灌胃羟基脲加尾静脉注射高分子右旋糖酐方法建立肾虚血瘀薄型子宫内膜联合模型。将实验大鼠分为正常组、模型组、戊酸雌二醇组、EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组，每组8只。各组大鼠给予相应的方法干预后，经过3个动情周期处死后取材。采用HE染色观察各组子宫内膜厚度、腺体和血管分布情况，免疫组化、Western blot检测角蛋白、波形蛋白的表达情况。结果 在改善子宫内膜厚度方面，EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组及EDSCs+IU+中药组较模型组内膜厚度均增加，差异有统计学意义(P<0.01);在增加子宫内膜腺体数方面，EDSCs+IV组较模型组腺体数增加，差异有统计学意义(P<0.05),EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组腺体数增加，差异有统计学意义(P<0.01);在增加子宫内膜血管数方面，EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组血管数增加，差异有统计学意义(P<0.01);在改善角蛋白表达方面，EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01);在改善波形蛋白表达方面，EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01);在改善子宫内膜厚度、免疫组化检测波形蛋白表达方面宫腔注射EDSCs与尾静脉注射EDSCs比较，差异有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组比较、EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较子宫内膜厚度显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 宫腔注射EDSCs在增加子宫内膜厚度、免疫组化检测波形蛋白表达方面更优于尾静脉注射EDSCs;加用补肾活血方后有助于增加子宫内膜厚度。
关键词：补肾活血方 薄型子宫内膜 模型大鼠 子宫内膜干细胞移植 子宫内膜形态学 中药研究
Effect of Bushen Huoxue Decoction on endometrial morphology of thin endometrial rats treated with endometrial stem cell transplantation
YIN Xiaodan HE Junqin XIN Mingwei WU Ying HAN Qian YANG Wei
Department of Traditional Chinese Medicine,Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University;
Abstract：Objective To investigate the effect of Bushen Huoxue Decoction on endometrial morphology in rats with thin endometrium treated by transplantation of endometrial stem cells(EDSCs). Methods EDSCs were isolated from the endometrium of 8-week-old female SD rats by the methods of mechanical separation and two-step enzyme elimination. The third generation cells with high purity were selected and transplanted into the experimental rats by tail vein and intrauterine injection respectively. The combined model of thin endometrium with kidney deficiency and blood stasis was established by infusing 95% ethanol without water into the uterine cavity and injecting hydroxyurea and high molecular dextran into the tail vein of female SD rats. The experimental rats were divided into normal control group, model group, estradiol valerate group, EDSCs + IV group, EDSCs + IU group,EDSCs + IV+ traditional Chinese medicine( TCM) group and EDSCs + IU + TCM group,with 8 rats in each group. After intervention with corresponding methods,the rats in each group were killed after 3 estrous cycles. HE staining was used to observe the thickness of uterus,the number of glands and blood vessels,and the expressions of keratin and vimentin by immunohistochemistry and Western blot. Results In terms of improving endometrial thickness,the endometrial thickness in the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU+TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01); in terms of increasing the number of endometrial glands,the number of glands in the EDSCs+IV group was significantly higher than that in the model group( P < 0. 05),and that in the EDSCs + IU group,the EDSCs + IV + TCM group and the EDSCs + IU + TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01); in terms of increasing the number of endometrial blood vessels,the number of blood vessels in the EDSCs+IV group,the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU+TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01); in terms of improving the expression of keratin,the expression of keratin in the EDSCs+IV group,the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU +TCM group was significantly higher than that in the model group( P < 0.01); in terms of improving the expression of vimentin,the expression of vimentin in the EDSCs+IV group,the EDSCs+IU group,the EDSCs+IV+TCM group and the EDSCs+IU +TCM group was significantly higher than that in the model group( P<0.01). There was significant difference between intrauterine injection of EDSCs and tail vein injection of EDSCs in improving the thickness of endometrium and the expression of vimentin detected by immunohistochemistry( P<0.01). The endometrial thickness in the EDSCs+IV+TCM group was significantly higher than that in the EDSCs+IV group,and that in the EDSCs+IU+TCM group was significantly higher than that in the EDSCs+IU group( P<0.01). Conclusion Intrauterine injection of EDSCs is better than tail vein injection in increasing endometrial thickness and vimentin expression detected by immunohistochemistryl,and adding Bushen Huoxue Decoction helps to increase the thickness of endometrium.
Keyword：Bushen Huoxue Decoction; thin endometrium; model rats; endometrial stem cell transplantation; endometrial morphology; traditional Chinese herbol medicine research;
薄型子宫内膜(thin endometrium)通常是指当卵泡发育成熟(直径≥18 mm)时或人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)注射日，子宫内膜厚度≤7 mm[1]。其主要临床表现为月经量过少，进而影响胚胎种植，导致不孕，甚至增加自然流产的风险。有研究表明，子宫内膜容受性差，人类胚胎无法着床，进而可导致妊娠失败[2]。薄型子宫内膜的病因尚未明确。有研究发现，薄型子宫内膜的形成主要与子宫内膜雌、孕激素效能下降[3]、宫腔刮宫等操作史[4]、长期(≥5年)服用复方口服避孕药等有关[5]。子宫内膜干细胞(endometrial stem cells, EDSCs)是一种成体干细胞，致癌风险低，操作简单，可以从人的月经血、子宫内膜等组织中分离、培养[6],在严格的操作规范下可以大规模生产，这为EDSCs用于治疗薄型子宫内膜等内膜因素导致的胚胎无法着床等引起的不孕提供了可能性[7],但在实际应用中仍存在分离后缺乏EDSCs特异性表面标记物鉴定以及EDSCs数量少、归巢位置不明确以及分化能力差等问题。因此，在采用EDSCs治疗薄型子宫内膜过程中如何增加EDSCs移植数量、促进EDSCs定向归巢等是亟待解决的问题。
诸多研究表明，中医药对于薄型子宫内膜的防治具有多靶点、疗效好、副作用少等优势，加用中药促进移植EDSCs的归巢、提高治疗效果成为EDSCs移植治疗薄型子宫内膜基础研究的新方向。为此，本研究采用肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠联合模型，拟通过补肾活血方干预不同的移植EDSCs方式作用下的大鼠，观察其对薄型子宫内膜大鼠子宫内膜形态学的影响，进而为进一步探讨补肾活血方调控EDSCs向子宫内膜靶向归巢奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
SPF级8～10周雌性SD大鼠70只，体质量(220±30)g, 标准颗粒饲料及洁净饮用水喂养，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK(京) 2016-0004。动物使用许可证号：SYXK(京)2015-0004。动物饲养于北京农学院，适应环境3 d, 自由饮水、进食，室温(22±1)℃,湿度(40±10)%,光照周期12 h/12 h。动物伦理号：20190801LL。
1.1.2 药物与试剂
补肾活血方组成：淫羊藿10 g, 肉苁蓉10 g, 鹿角15 g, 熟地黄10 g, 菟丝子10 g, 覆盆子10 g, 枸杞子10 g, 山茱萸10 g, 丹参10 g, 赤芍10 g, 生蒲黄10 g, 鸡血藤15 g, 红花10 g, 当归10 g, 川芎10 g, 泽兰10 g, 益母草12 g, 牛膝10 g, 柴胡6 g, 香附10 g, 木香6 g, 羌活6 g, 细辛3 g。上述药物经煎煮浓缩后调整浓度至4 g/mL(人服用剂量为1剂/d),放置于4 ℃冰箱贮存备用。以上药物由北京同仁堂有限公司加工提供。
戊酸雌二醇(补佳乐，1 mg/片),拜耳公司(批号：J20130009),人用量3 mg/d。按照人的体质量70 kg, 大鼠与人的等效剂量比值是6.3,故确定大鼠的用药剂量为0.3 mg·kg-1·d-1。
羟基脲，齐鲁制药有限公司(批号：H37021289),人用量5 g/d。按照人的体质量70 kg, 大鼠与人的等效剂量比值是6.3,故确定大鼠的用药剂量为450 mg· kg-1·d-1。
高分子右旋糖酐(Dextran70), 瑞士Amwesham Biosciences公司。参照文献[8],确定大鼠的用药剂量为5 mL/kg。
L-DMEM培养基，美国Gibco公司(批号：11885084);胰蛋白酶，美国Gibco公司(批号：25200056);胎牛血清，美国Gibco公司(批号：10099133C);青霉素、链霉素，美国Gibco公司(批号：10378016);无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司(批号：10009218);苏木精染色、伊红染液、生物素标记的山羊抗兔IgG,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；波形蛋白一抗、角蛋白一抗，美国Abcam公司(批号：ab8069、ab8068)。
1.1.3 仪器
超净工作台，苏州净化工程公司(型号：YJ-875S);台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司(型号：TGL-16M);细胞培养箱，美国Thermo Scientific公司(型号：311);倒置显微镜，日本Olympus株式会社(型号：BX60);光学显微镜，南京江南光电股份有限公司(型号：XD-202);全自动包埋机，武汉俊杰电子有限公司(型号：JB-P5)。
1.1.4 EDSCs的分离及培养
取大鼠子宫，观察子宫大体标本，并纵行剖开部分子宫暴露宫腔观察，后浸入4%多聚甲醛中固定待查。将手术取得的组织用PBS冲洗3次，加入胶原酶Ⅲ(300 mg/L)+DNA酶(40 mg/L),置于30 ℃恒温水浴摇床(150 r/min)消化45 min, 加入含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化，100目滤网过滤，收集滤液。400目滤网过滤，分离基质细胞(<400目)。收集悬液，1 000 r/min离心10 min, 弃上清，沉淀用1 mL培养液重悬，缓慢滴加到含有8 mL培养液的离心管内，400 r/min离心3 min, 去除成团细胞。将上清液转移到另一离心管中，1 000 r/min离心10 min, 弃去上清液，底部沉淀即为纯化的子宫内膜基质细胞。用含20%FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养4 h后换液，去除不贴壁细胞，倒置显微镜下连续动态观察细胞生长及形态特征。上述细胞原代细胞铺满90%瓶壁时用0.25%胰酶-0.1%EDTA消化液消化，1∶2传代。根据前期实验基础，P1、P3、P5细胞生长曲线趋势相似，在体外培养的前3天，细胞生长缓慢，曲线较平缓，为细胞生长的潜伏生长期，第3～5天细胞生长迅速，为生长周期的指数增生期，培养第6天后细胞生长几乎停止，为生长平台期。通过比较3代细胞的生长曲线，可发现P5增长速度较P1、P3慢，有较长的细胞倍增时间，P3细胞形态趋于一致，细胞表型稳定，可以获得高出度的EDSCs, 因此取P3细胞冻存备用。
1.2 造模
肾虚血瘀薄型子宫内膜模型的建立参照参考文献[8-10],根据前期实验基础成模率约为80%。SD大鼠采用羟基脲450 mg·kg-1·d-1给大鼠灌胃，每日1次，连续8 d, 于实验末次给药30 min后尾静脉快速推注10%高分子右旋糖酐5 mL/kg。给羟基脲8 d后，发现大鼠被毛枯槁欠光泽，体型瘦小，耳、爪、尾部颜色偏暗，以及精神萎靡、大便溏等肾虚症状；尾静脉快速注射10%高分子右旋糖酐后，观察发现大鼠耳、爪、尾部颜色紫暗，提示有血瘀，最终造成肾虚血瘀模型。将肾虚血瘀模型SD大鼠麻醉、固定、备皮、常规消毒，从尿道口上端约3 cm处正中纵向切开皮肤约2～3 cm, 逐层分离进入腹腔，在膀胱后方找到子宫，呈“V”型，在其下端汇合处用血管夹夹住，用无齿镊将一侧子宫拉直，子宫周围垫有无菌纱布，在宫角下0.5 cm处以1 mL针管沿子宫长轴进入宫腔，注入95%的无水乙醇，见子宫膨隆且针孔处无明显液体流出(注入液体约0.3 mL),即停止注药，保持针头在宫腔内；为保证宫腔的充盈状态，2 min后再次缓慢注药，如此重复，使液体在宫腔贮留5 min, 取出针头。另一侧子宫操作如上，反复冲洗腹腔，用棉垫将冲洗液吸干，恢复子宫解剖位置，逐层关腹。
造模成功后，随机取3只动物，经过3个动情周期后的动情期，开腹取子宫，观察大体标本，4%多聚甲醛固定。HE染色，在光学显微镜下读片，在低倍镜下观察，摄片。釆用Leica Qwin Plus图像处理软件测定子宫内膜厚度，即子宫内膜肌层交接处至宫腔的垂直距离，每张片子选取5个部位，取平均值作为该切片的子宫内膜厚度，以证实薄型子宫内膜模型制作成功。模型组大鼠出现拱背，蜷缩少动，反应较为迟钝，背部被毛疏松不光亮，脱毛，大便偏稀，部分出现便溏等为造模成功，并且观察发现大鼠耳、爪、尾部颜色紫暗等，提示肾虚血瘀模型造模成功[11]。
1.3 分组与干预
造模成功率约80%左右，取存活的56只SD大鼠随机分为7组，每组8只。
(1)正常组：
灌服0.9%NaCl溶液。
(2)模型组：
建立肾虚血瘀薄型子宫内膜模型后，灌服0.9%NaCl溶液。
(3)戊酸雌二醇组：
建模后，灌服戊酸雌二醇。
(4)EDSCs+IV组：
建模后，经尾静脉注射(IV)移植含1×107EDSCs的PBS细胞悬液体1 mL。
(5)EDSCs+IU组：
建模后，经宫腔注射(IU)移植含1×107EDSCs的PBS细胞悬液体1 mL。
(6)EDSCs+IV+中药组：
建模后，经尾静脉移植含1×107 EDSCs的PBS细胞悬液体1 mL,并灌服补肾活血方。
(7)EDSCs+IU+中药组：
建模后，经宫腔移植含1×107 EDSCs的PBS细胞悬液体1 mL,并灌服补肾活血方。
补肾活血方剂量参照《药理实验方法学》[12]中人鼠等效剂量换算。人用：1剂/d, 223 g/剂。按照人的体质量70 kg, 大鼠与人的等效剂量比值是6.3,故大鼠的剂量为：1剂·d-1/70 kg×6.3=0.09剂·kg-1·d-1=20.07 g·kg-1·d-1。前期课题组实验已确定补肾活血方的最佳使用剂量为高剂量，约为40.1 g·kg-1·d-1,故实验中灌胃均采用此剂量，1次/d, 连续3个动情周期。
于移植后经过大鼠3个动情周期，取出大鼠子宫，部分用4%多聚甲酸固定，部分置入液氮中冻存备用。
1.4 检测指标与方法
1.4.1 EDSCs细胞形态观察
倒置显微镜下观察细胞生长及形态特征。镜下可见EDSCs呈长梭形，成纤维细胞样，可见粗细不等的胞质突起。
1.4.2 HE染色
常规HE染色后，在光镜下观察子宫各层厚度变化、腺体和血管分布情况、腔上皮或者腺上皮细胞形态学变化。釆用Leica Qwin Plus图像处理软件测定子宫内膜厚度，即子宫内膜肌层交接处至宫腔的垂直距离，每张片子选取5个部位，取平均值作为该切片子宫内膜厚度。低倍镜下根据腺体和血管的形态，计数子宫内的腺体数和血管数。
1.4.3 免疫组化检测子宫内膜细胞角蛋白、波形蛋白表达
(1)抗原修复：
0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)1 000 mL倒入烧杯，置烧杯于微波炉中加热至沸腾，再把装好石蜡子宫切片的切片架放到烧杯内，保证切片完全浸没在修复液中，放微波炉中继续中火10 min, 取出后待其自然冷却；用PBS轻轻漂洗3次，每次3 min。
(2)阻断内源性过氧化物酶：
每张玻片上滴加3%H2O2溶液，置室温10 min; PBS漂洗3次，每次3 min; 甩干玻片上水分，滴加一抗覆盖切片组织，其中角蛋白抗体稀释比例1∶50;波形蛋白抗体稀释比例1∶200,整合素β3抗体稀释比例1∶100,放入湿盒内，4 ℃孵育过夜；第2天取出湿盒在常温下复温45 min, 再PBS漂洗3次，每次3 min; 滴加二抗，50 μL/片，37 ℃静置30 min, 其中角蛋白、整合素β3滴加山羊抗兔抗体多聚体；波形蛋白滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体；PBS漂洗3次，每次3 min。
(3)DAB显色：
取1滴DAB浓缩液加入1 mL DAB底物缓冲液避光混匀，制成DAB工作液(30 min内使用),每张玻片滴加DAB工作液显色2～3 min, 显微镜下观察染色情况，待染色结束用自来水冲洗。
(4)复染：
置玻片于苏木素染液中，复染5～10 min, 自来水冲洗。
(5)分化：
置玻片于1%盐酸乙醇中，分化30 s, 自来水冲洗30 min。
(6)封片：
甩干玻片，滴加适量中性树胶，并用盖玻片封片。显微镜下观察子宫内膜细胞角蛋白、波形蛋白表达情况。
1.4.4 Western blot法检测子宫内膜细胞角蛋白和波形蛋白
取出冻存在液氮中组织称重，然后放入已预冷的研钵中进行研磨，变研磨边加入液氮，直至成粉末状；加入预冷的细胞裂解液1 mL(含PMSF)冰上裂解30 min; 4 ℃、12 000 r/min离心10 min, 弃去沉淀，取上清液进行蛋白分光光度仪定量。组织蛋白法进行蛋白浓度测定；SDS-PAGE电泳；转膜和封闭；封闭与抗体解育免疫反应；化学发光，显影，定影；图像分析。应用胶片瞬变显示系统扫描胶片，Quantity One图像分析软件分析目标条带的光密度值(OD),将待测蛋白条带与同一泳道β-actin条带的光密度比值作为结果。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示 ,多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对EDSCs细胞形态的影响
倒置显微镜下观察可见细胞量多，且主要是圆形细胞悬浮于培养液中，约24 h后即可见少量贴壁细胞，且细胞形态不一；3 d后观察可见贴壁细胞明显增多，多呈梭形；培养4～5 d后可见贴壁细胞呈漩涡状或辐射式生长；7～10 d后即可见细胞集落融合成片，铺满培养瓶底部，经消化传代后的细胞贴壁较快，后续实验选P3代细胞进行实验。见图1。
图1 子宫内膜干细胞(EDSCs)形态(×100)
2.2 子宫内膜HE染色结果
对照组子宫内膜结构完整，呈波浪形，腺上皮和腔上皮细胞完整，呈立方状，腺体和血管数量正常；模型组子宫内膜厚度明显变薄，腺上皮和腔上皮细胞呈扁平状，腺体稀少，毛细血管数量减少，内膜连续性差；戊酸雌二醇组、EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组各组内膜厚度均有不同程度的增加，腺体数和血管数也有不同程度的增多。见图2。
图2 各组大鼠子宫内膜形态(HE染色，×40)
2.3 各组子宫内膜厚度的比较
模型组较正常组内膜厚度降低，差异有统计学意义(P<0.01)。戊酸雌二醇组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组内膜厚度均增加，差异有统计学意义(P<0.01)。EDSCs+IV组较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组比较，内膜厚度差异有统计学意义(P<0.01)。EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较，内膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组大鼠子宫内膜厚度比较(n=8,x¯±s,μm)
2.4 各组子宫内膜腺体数的比较
模型组较正常组腺体数减少，差异有统计学意义(P<0.01)。戊酸雌二醇组、EDSCs+IV组较模型组腺体数增加，差异有统计学意义(P<0.05)。EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组腺体数增加，差异有统计学意义(P<0.01)。EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组、EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较，腺体数差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 各组大鼠子宫内膜腺体数比较(n=8,x¯±s,个)
2.5 各组子宫内膜血管数的比较
模型组较正常组血管数减少，差异有统计学意义(P<0.01)。戊酸雌二醇组、EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组血管数增加，差异有统计学意义(P<0.01)。EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组、EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较，血管数差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 各组大鼠子宫内膜血管数比较(n=8,x¯±s,个)
2.6 各组免疫组化检测角蛋白、波形蛋白表达的比较
角蛋白：模型组较正常组降低，差异有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组差异无统计学意义(P>0.05);戊酸雌二醇组、EDSCs+IU组较模型组升高，差异有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组、EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
波形蛋白：模型组较正常组表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01);戊酸雌二醇组、EDSCs+IU+中药组较模型组升高，差异有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IU组较模型组表达量显著升高(P<0.05);EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组较模型组有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05);EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较差异有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图3、图4。
表4 各组免疫组化检测角蛋白、波形蛋白 表达的比较(n=8,x¯±s)
图3 各组免疫组化检测角蛋白表达的比较(×100)
图4 各组免疫组化检测波形蛋白表达的比较(×100)
2.7 各组Western blot检测角蛋白、波形蛋白表达的比较
角蛋白：模型组较正常组表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01);戊酸雌二醇组、EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组、EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
波形蛋白：模型组较正常组表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01);戊酸雌二醇组、EDSCs+IV组、EDSCs+IU组、EDSCs+IV+中药组、EDSCs+IU+中药组较模型组表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.01);EDSCs+IU组与EDSCs+IV组、EDSCs+IV+中药组与EDSCs+IV组、EDSCs+IU+中药组与EDSCs+IU组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5、图5。
表5 各组角蛋白、波形蛋白表达的比较(n=8,x¯±s)
3 讨论
研究发现，人子宫内膜组织中存在干细胞，有上皮干细胞和间质干细胞两种类型，而功能层与基底层中存在大量的间质干细胞[13]。近年来研究发现，越来越多的学者认为薄型子宫内膜的发生与子宫内膜中的干细胞受损及减少有关。且种种研究表明，移植干细胞可能会参与子宫内膜形成[14-15]。但在实际应用中仍存在分离后缺乏EDSCs特异性表面标记物鉴定以及EDSCs数量少、归巢位置不明确以及分化能力差等问题。因此，在采用EDSCs治疗薄型子宫内膜过程中，如何增加EDSCs移植数量、促进EDSCs定向归巢等是近年来研究的热点。
中医古籍中没有对“薄型子宫内膜”的病名记载，薄型子宫内膜的临床表现主要是月经过少或不孕，故中医将本病多归结为“经水涩少”“不孕”等。我科室临床中对1 000多例薄型子宫内膜患者进行的证候要素聚类分析结果显示，聚为四类时，第一类的证候主要为月经色暗红、痛经、经期肛门坠胀、腰膝酸软、面色晦暗、胸胁刺痛、腰痛耳鸣、舌紫暗、舌苔薄、脉沉涩，证型名称为肾虚血瘀证，所占比例最大，为42.28%。因此，补肾填精、养血活血是通过中医药改善薄型子宫内膜的关键[16]。
本研究所采用的补肾活血方是我院中医科创始人赵松泉主任总结几十年临床经验所创制的，主要由补肾药配伍活血药而成。方中淫羊藿、肉苁蓉、鹿角温补肾阳；熟地黄、菟丝子、覆盆子、枸杞子、山茱萸，滋补肝肾之阴；丹参、赤芍、生蒲黄、鸡血藤、红花、当归、川芎、泽兰、益母草补血、养血、活血，疏通经脉、化瘀生新。课题组前期对补肾活血方进行了大量研究，结果提示，补肾活血方不仅能够调控Wnt/β-catenin 信号通路，增加子宫内膜厚度、腺体数、血管数，有效改善子宫内膜容受性相关指标，促进内皮细胞增殖、迁移，还可以通过增加VEGF等的表达促进血管新生[17-18]。但在补肾活血方促进EDSCs移植治疗薄型子宫内膜方面为初次涉及。
本研究主要观察补肾活血方联合不同的移植EDSCs方式对肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠子宫内膜形态学的影响。干细胞可通过其无限自我更新和增殖分化的能力促进子宫内膜的再生和修复，因此在治疗薄型子宫内膜方面有良好的前景[19]。EDSCs被确认为标志保留细胞，可能通过间充质细胞到上皮细胞的转化，显示出在子宫内膜修复和再生中的作用，而且EDSCs可以很容易且无创地获得，具有广泛扩增和快速扩增的特性。EDSCs在治疗薄型子宫内膜方面有再生和修复的作用，其作用机制可能为通过促进波形蛋白、VEGF以及细胞角蛋白的表达，从而重建子宫内膜[20]。
本研究结果发现，宫腔注射EDSCs在增加子宫内膜厚度以及波形蛋白表达方面更优于尾静脉注射EDSCs, 这可能是因为宫腔注射更加直接，使得EDSCs能够归巢到宫腔，能够迅速分化成子宫内膜细胞，从而增加子宫内膜厚度；尾静脉注射的EDSCs可能归巢到到宫腔的数量会下降，从而效果不如宫腔直接注射。加用补肾活血方后能更好的增加子宫内膜厚度。补肾活血方对于EDSCs移植治疗薄型子宫内膜容受性其他方面指标的影响有待课题组进一步研究和探讨。
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