一次性使用医疗器材微生物总数检查方法的研究论文
岳君
摘要：随着科技的发展，人们生活水平的提高，对一次性使用医用制品的要求越来越高，企业也不惜余力的改进自己的产品质量，但并不是所有检验均能满足产品的需要，这就要求检验人员综合考虑，根据本公司产品的特点制定出一系列可行的检查方案，能充分保证产品的质量。本文生物医学工程论文中所述产品包括一次性使用血液回路等管路类产品和麻醉针等实体类产品，一些检查方法对这些产品不适用，本文将就医疗器材微生物总数检查方法的可行性、操作方法进行探讨。
关键字：微生物、薄膜过滤、初始污染菌、冲洗方法验证、校正因子、产品检验。
一、目前检测产品上微生物总数时，洗脱微生物的方法主要有以下几种：
1.袋蠕动法
将试验部分和一已知容量的洗提液装在一个无菌胃型袋中，在袋中开动往复式搅动棒，使洗脱液贯串试验部分内外。该方法适用于软质、纤维类材料。
2.超声法
将实验部分浸入装有已知容量洗提液的适当容器中，在超生波清洗中处理容器及其内装物或将超声波探头浸入到容器内洗脱液中进行处理。超声波也能使微生物失去活性，尤其当大能量传输时，使用探头会比在超声波清洗中更有可能使其失去活性。
3.振动法（机械或手工方式）
将实验部分浸入装有已知容量的洗提液的适当容器中，并在机械振动（如往复式、轨道式或机械腕摇床）里进行振动。也可用手工振动，但其效力会因操作人员而异。
4.涡旋混合法
将实验部分浸入装有已知容积浸提液的密闭容器内，该密闭容器放置在形成涡旋的漩涡混合器的旋转托盘上。涡旋的形成取决于手动施加的压力，涡旋中的变化会引起微生物去除的变化。
5.冲洗法
让浸提液通过试验部分的内腔。可以靠重力或加泵来使液体流动。另外也可将洗脱液冲入产品中并夹住和抖动。
6.搅拌法
将试验部分浸入装有已知容积洗提液的适当容积内，在规定的一段时间内搅拌或搓摇试验部分。
7.擦拭法
准备一个无菌的棉拭子占浸提液将产品里外擦拭一遍，将拭子放入准备好的浸提液中作为检验液检验。
以上七种方法均有优缺点，虽然方法很全面，但结合一次性使用血液管路和麻醉针的特点，本文介绍一种综合提取的方法进行检测，并对该方法进行了方法学的验证。该方法有较好的洗脱效果，能基本反映这几种产品的微生物负载情况。
二、具体方案如下所述
1.所用设备及要求
1.1环境要求
检测此项目需在万级净化室，同时满足在百级操作台中进行。
1.2所用设备及器皿工具
高压蒸汽灭菌机、干热灭菌机、恒温培养箱、移液管、培养皿、显微镜、试管、三角瓶、无菌袋、灭菌盒、接种环、酒精灯、剪刀、镊子、无菌手套、无菌工作服、真空泵、滤膜、滤瓶。
1.3培养基、菌种、浸提液（PH=7.0氯化钠蛋白胨缓冲液）
2.方法验证和产品试验的全过程
2.1计数培养基的适用性检查
2.1.1 所用菌种
大肠埃希菌[CMCC(B)44102]
金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]
枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]
生孢梭菌[CMCC(B)64941]
白色念珠菌[CMCC(F)98001]
黑曲霉[CMCC(F)98003]
2.1.2. 菌液制备
2.1.2.1将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，将生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，35 ℃培养24小时，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。
2.1.2.2将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，24℃培养48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。
2.1.2.3将黑曲霉菌的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，24℃培养5天，，加入5毫升含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10毫升吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数50-100cfu的孢子悬液。
2.1.3 培养基适用性检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50--100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30-35℃培养48h，计数；取生孢梭菌50--100cfu加入到25-30毫升硫乙醇酸盐流体培养基（含琼脂，每15g培养基加入0.4g琼脂）的试管中，振荡混匀，平行制备两支试管。置30--35℃厌氧条件下培养24h，计数。
取白色念珠菌、黑曲霉各50--100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠培养基，每株试验菌平行制备2个平皿混匀凝固置23-28℃培养72h计数。
取白色念珠菌50--100cfu注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿混匀凝固置23-28℃培养72h计数。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
2.1.4 结果判定若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
2.2冲洗方法验证
2.2.1管类产品
取灭菌前样品，用200毫升PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗内腔，振摇1分钟(30次/分
钟）汇集冲洗液作为检验液，膜过滤法过滤，于相应温度恒温箱中培养，计数。重复操作冲洗
4次。
2.2.2实体类产品
直接放入一无菌的袋子中，加入100毫升PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，振摇1分钟(30
次/分钟）汇集冲洗液作为检验液，膜过滤法过滤，于相应温度恒温箱中培养，计数。重复
操作冲洗4次。
2.2.3琼脂覆盖
将样品剪成10cm长的段，较大产品放入无菌的盒子中，较小的产品直接放入培养皿中，倾倒
温度不超过45℃的融化的相应培养基，培养后计数。
2.2.4 每种产品根据性质再重复以上操作进行3次独立的平行试验
2.2.5校正因子的计算：
2.2.5.1总回收量：为每套产品冲洗四次总的菌落数加上琼脂覆盖菌落数。 2.2.5.2计算公式 ： 去除率=（首次处理移除量/总菌落数）*100% 平均回收率=去除率/3 。
校正因子=1/平均回收率
2.2.6每次试验的菌回收率应不低于70%。若任一次试验中菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除产品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
2.3 产品的检验：
2.3.1 薄膜过滤法：
2.3.1.1管类产品
2.3.1.a取灭菌前样品，用200毫升PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗内腔，振摇1分钟(30次
/分钟）汇集冲洗液作为检验液，膜过滤法过滤，于相应温度恒温箱中培养，计数。重复操
作冲洗4次。
2.3.1.b封闭产品两端开口，放入一个无菌的袋子中，加入400毫升PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲
液，振摇1分钟(30次/分钟）汇集冲洗液作为检验液，膜过滤法过滤，于相应温度恒温箱
中培养，计数。重复操作冲洗4次。
2.3.1.2实体类产品直接放入一无菌的袋子中，加入100毫升PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，振
摇1分钟(30次/分钟）汇集冲洗液作为检验液，膜过滤法过滤，于相应温度恒温箱中培养，
计数。重复操作冲洗4次。
2.3.2 琼脂覆盖：将样品剪成10cm长的段，较大产品放入无菌的盒子中，较小的产品直接放入培养
皿中，倾倒温度不超过45℃的融化的相应培养基，培养后计数。
2.3.3 阴性对照试验：取试验用浸提液100毫升，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照
不得有菌生长。
2.4 培养和计数
细菌培养3天，逐日点计菌落数，厌氧菌培养3天，计数，霉菌、酵母菌培养5天，逐日点计菌
落数，必要时延长培养时间至7天进行菌落计数报告。按菌数报告规责报告菌数。
2.4.1 菌数报告规则：计数整套供试品的菌落数，若滤膜上无菌落生长，以小于1报告菌数，如大于1
则以实际菌数乘以校正因子加琼脂覆盖菌数的值报告整套产品的菌落数。
2.4.2整套产品菌落数计算
产品菌数=（内壁4次冲洗所有菌数*内壁校正因子+外壁4次冲洗所有菌数*外壁校正因子）+琼脂覆盖菌数
三、论文总结
此方法在对一次性使用医疗器材上微生物提取检验过程，较其它方法简便易行，数据较准确，适用于这些产品的检测。
四、参考文献
[1]ISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices—Microbiological methods---Part1:Determination of a population of micoroorganisms on products
[2]中华人民共和国药典2010版
[3]YY0267-2010心血管植入物和人工器官血液净化装置的体外循环血路
[4]ISO10993-1:1997 Biological evaluation lf medical devices—Part 1:Evalration and testing(GB/T16886.1-2001医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验)
[5]ISO10993-12:2002 Biolofical evaluation of medical devices---Part 12:Sample preparation and refrence materials(GB/T16886.12-2005医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品)
[6]GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准
[7]微生物学使用手册
