四甲基偶氮唑盐比色法测定Vero毒素-1的CD５０研究

　　【摘要】 肠出血性大肠杆菌能引起出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征，其主要血清型O157：H7于1982年首次在美国被发现，从而引起出血性结肠炎的爆发流行。1996年在日本也发生了O157：H7大肠杆菌爆发流行，共有九千多名儿童感染，死亡12例[1～3]，我国也有O157：H7的感染病例。

　　【关键词】 Vero毒素-1,四甲基偶氮唑盐,CD50

　　肠出血性大肠杆菌的致病作用主要通过细菌对肠道上皮细胞的黏附和产生毒素两个过程，Vero毒素是其中的主要毒力因子。根据免疫原性，毒素又可分为Vero毒素-1和Vero毒素-2两种。Vero毒素-1有A，B两种亚基组成，其中B亚基的分子量为7.7KDa，它与宿主肠壁黏膜细胞的糖脂受体GB3结合，介导A亚基进入细胞，干扰蛋白质的合成[4～7]。

　　为了检测Vero毒素-1的毒性，需建立一种适用于常规检测的方法。以前测定细胞毒性一般采用3H-TdR掺入法或肉眼目测法，前者由于使用了同位素，因而不适用于常规检测，后者受实验者个人经验等因素的影响，所以重复性较差。

　　1983年Mcsmann介绍了用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞毒性，由于其操作简便，不使用同位素等优点，现已逐步用于许多研究工作中[8，9]。本实验室应用四甲基偶氮唑盐比色法测定了Vero毒素-1的CD50，为检测Vero毒素-1的毒性提供了一种新的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞及培养 实验所用细胞为vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。细胞在MEM培养液(含10%小牛血清2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)于5%CO2的培养箱中37℃培养。

　　1.2 四甲基偶氮唑盐溶液 四甲基偶氮唑盐3-(4，5-Dinetyl-2thiazolyi)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolooum bromid溶于pH 7.2的PBS缓冲液中，浓度为50mg/ml，除菌后于4℃避光保存，使用前用含0.5%小牛血清的MEM培养液稀释至5mg/ml。

　　1.3 Vero毒素-1 由本实验室自制。

　　1.4 细胞死亡率的测定 Vero细胞培养于96孔细胞培养板中(104个/孔)，在5%CO2，37℃条件下培养24h后，每孔加入用Eagle’s MeM(5%小牛血清)10倍系列稀释的毒素100μl，培养72h后，吸除药液，每孔加入新鲜配制的四甲基偶氮唑盐溶液(99% MeM，0.5%小牛血清，0.5%四甲基偶氮唑盐溶液)37℃温育2h，吸取上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡30min，在酶标仪上测定OD570，以不加细胞和培养基，只加四甲基偶氮唑盐溶液和二甲基亚枫的孔为空白孔，以有细胞而不加毒素的孔为对照孔，计算细胞死亡率。细胞死亡率按下式计算：

　　1.5 CD50的测定 CD50的测定方法同细胞死亡率的测定，将纯化的毒素连续倍比稀释后，测定每个浓度的死亡率，以引起50%细胞死亡的最小毒素蛋白质含量为CD50。

　　2 结果

　　在细胞培养孔中加入毒素后24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。

　　用连续稀释毒素，四甲基偶氮唑盐比色法测得CD50为1pg。

　　3 讨论

　　活细胞在生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可以将黄色的四甲基偶氮唑盐分解成蓝紫色的Fonnazan，生成的Fonnazan量的多少与细胞的数量和细胞的活性成正比。但是，Fonnazan不溶于水，溶于有机剂[10，11]。本实验室在细胞加入四甲基偶氮唑盐，经培养产生Fonnazan后采用二甲基亚枫裂解细胞，并将沉淀在细胞内的不溶性Fonnazan溶解，然后才能测定其OD值。

　　本实验根据活细胞的这一特征，建立了测定vero毒素-1 CD50的四甲基偶氮唑盐法，该方法与传统的3H-Tdr掺入法相比有许多的优点，如方法简便、避免使用同位素以及结果容易读取等;与肉眼目测法相比，该方法重复性好，不受实验者工作经验等主观因素的影响。本方法同样适用于其他毒素细胞毒性的测定，值得推广。

　　【参考文献】

　　1 O’Brien AD，Laveck GD，Thompson MR and Formal SB.Producing of Shgella dysentriae type 1-like cytotoxin by Escherichia coli.J Infect Dis，1982，146(6)：763-769.

　　2 扬平，扬会利，林怡芳.O157∶H7感染症的流行概况.国外医学·卫生学分册，1997，24(3)：170-173.

　　3 Marques LRM，Moore MA，Wells JG，et al.Producing of Shiga-like toxin by Escherichia coli.J Infect Dis，1986，154(2):238-341.