应用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体的效果
作者：无忧期刊网 来源：期刊论文 日期：2023-04-10 08:38人气：
摘 要：目的 运用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体，并进行初步分析。方法 诱导表达p53蛋白，用其免疫小鼠。提取免疫小鼠脾脏组织的总RNA，通过反转录PCR和重叠延伸PCR分别扩增抗体重链可变区基因VH-Linker和轻链可变区基因VL-Linker，并合成VH-linker-VL型单链抗体基因。TNT T7Quick for PCR DNA试剂盒对单链抗体基因进行体外转录与翻译，以p53蛋白为靶标，经过5轮筛选富集ScFv基因。将获取单链抗体片段进行原核表达后，采用ELISA法和细胞免疫学法检测。结果 成功构建抗p53单链抗体库，并筛选出p53蛋白具有较强结合活性的单链抗体株p53-scFv1、p53-scFv2和p53-scFv3，可用以检测细胞中的p53蛋白。结论 利用核糖体展示技术获得亲和力较好的抗人p53单链抗体，可为p53抗体的制备提供新思路。
关键词: p53蛋白; 单链抗体;核糖体;
Screening of anti-human p53 single chain antibody by ribosome display
technology
CHEN Yinnan LUO Wanmei LUO Cailin ZHENG Chenna GUONayan
Quanzhou Medical College
Abstract：Objective To screen and analyze anti-human p53 single chain antibody by ribosome display technology.Methods Immunemicewere induced expression of p53 protein. Total RNA was extracted from spleen tissues of immunized mice. The VH-Linker and VL-Linker genes were amplified by reverse transcription PCR and overlapping extension PCR respectively, and VH-Linker-VL type SCFV genes were synthesized. TNT T7 Quick for PCR DNA kit was used in transcription and translation of single chain antibody gene, with p53 protein as the target SCFV gene was enriched after five rounds of screening. After prokaryotic expression, the SCFV fragments were detected by ELISA and cellular immunoassay.Results Anti-p53 single chain antibody library was successfully constructed.The single chain antibody strains p53-scFv1,p53-scFv2 and p53-scFv3 with strong binding activity were screened out to detect p53 protein in cells. Conclusion The ribosome display technology was used to obtain anti-human p53 SCFV with good affinity, which can provide a new idea for the preparation of p53 antibody.
Keyword：p53 protein; Single-chain antibody; Ribosome;
p53蛋白作为体内重要的转录因子，与机体的新陈代谢、免疫应答、DNA的修复、肿瘤的发生等代谢过程密切相关。p53蛋白由于半衰期较短（约20 min），一般胞内浓度处于较低水平。野生型的p53基因有抑癌作用，被称为基因卫士[1]。然而，当p53基因发生突变后，不仅失去了抑癌作用，而且促进了肿瘤细胞的形成，提高了对抗癌药的耐药性[2]。突变型的p53基因半衰期延长，在细胞内的含量会增加，可通过免疫学方法检测出来。检测肿瘤组织中p53蛋白的表达对早期诊断筛查、治疗方案及预后判断都有重要的参考意义[3,4]，因此，制备高效且便宜的p53抗体对p53蛋白的高效检测及进一步研究具有重要的作用。
随着基因重组技术的不断发展，抗体制备从传统的多克隆抗体、单克隆抗体发展到第三代基因工程抗体[5,6]。单链抗体作为新型的基因工程抗体，由含抗体重链可变区和轻链可变区组成，分子量小，细胞穿透能力强，无需经杂交瘤技术便可获得抗体[7]。核糖体抗体库技术通过PCR技术直接构建抗体基因文库，在体外进行转录和翻译，将核糖体表面表达的抗体与基因型进行偶联，最后用相应的目的蛋白筛选抗体[8,9]。该技术无需转化细胞，库容量大、操作简便[10]。本研究应用核糖体展示技术制备并筛选抗p53单链抗体，全程操作均在体外操作，过程简单、筛选效率高，便于大批量生产，为p53抗体的制备提供新思路。
1 材料和方法
1.1 材料
p53蛋白实验室保存；E.coli DH5α、E.coliBL21(DE3）、E.coli Rosetta(DE3）、pET-32a(+)vector、pET-27b(+)vector实验室保存；各种引物由上海生工生物有限公司合成；各种DNA限制性内切酶购自日本Takara公司；HRP标记的抗His-tag抗体购自美国Abcam公司；First Strand c DNA Synthesis Kit购自美Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗小鼠IgG/FITC标记购自北京中杉金桥生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白p53的分离纯化
将含有重组质粒pET-27b(+)-p53的E.coli DH5α菌株涂布于带有相应抗性的平板，培养过夜后，选取单克隆接种到含卡那抗性的LB液体培养基中，于37℃下过夜培养至对数生长期，提取质粒[11]。
将提取的pET-27b(+)-p53质粒分别用PCR、双酶切的方法进行验证，将验证正确的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3）感受态细胞中，接种于含卡那霉素和氯霉素抗性的LB固体平板筛选转化子。
选取的转化子接种于含抗性的液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养至OD600值达0.6时，加入0.2 mM IPTG诱导培养3 h，同时以不加IPTG诱导作为对照组。4℃、4000 rpm离心5 min收集菌体，超声破碎后，分离出破碎菌液的上清和沉淀，SDS-PAGE检测分析p53蛋白的表达。
1.2.2 构建抗p53单链抗体文库
将获得的p53蛋白结合Freund佐剂对小鼠进行注射免疫，共免疫3次，期间采集尾血测小鼠血清效价。达到要求后，从小鼠脾脏提取总RNA，反转录成c DNA，利用保守区引物扩增抗体的重、轻链[12]。具体引物序列如表1所示。
PCR反应条件：95℃预变性2 min,95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸50 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收。
通过重叠延伸PCR(SOE-PCR）将获得的VH-linker和VL-linker基因片段组装成VH-linker-VL单链抗体库。第一轮为无引物PCR，按顺序加入下列试剂：2×Ecotaq PCR supermix20μL、VH-linker和VL-linker各4μL、ddH2O12μL，共40μL。扩增条件为：95℃预变性2min;95℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1min，共10个循环。第二轮PCR反应体系为：2×Ecotaq PCR supermix 5μL、VH/back和Ck/for各2μL、ddH2O 1μL，扩增条件设为：95℃预变性2 min;95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min，共25个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收。
1.2.3 核糖体展示技术翻译与筛选
单链抗体库在无RNA酶的4℃环境中操作，于微量离心管中按顺序加入下列试剂：TNT T7 PCR Quick Master Mix 40μL、1 mM Methionine 1μL、DNA模板8μL、ddH2O 1μL，共50μL。于30℃水浴条件下反应90 min。
体外筛选步骤[13,14]：取100μL纯化后的p53蛋白包被于96孔板中，4℃反应过夜；次日，用PBS缓冲液洗涤3次，加入5%脱脂奶于37℃封闭1 h；再用PBSM缓冲液（含5 mmol/L MgCl2）洗涤3次；将翻译混合物按每孔50μL转至包被p53蛋白的孔板中，置于冰上反应2 h;PBSMT缓冲液（含0.5 mL/L Tween-20）洗涤3次；PBSM缓冲液洗涤2次；加入含20 mM EDTA的1×PBS缓冲液，在冰上放置10 min进行解离后吸取上清。以上清mRNA为模板，进行RT-PCR,PCR产物用以重复下一轮筛选。
1.2.4 抗p53 ScFv的克隆和表达
将最后一轮筛选获得的基因产物两端插入EcoR I和Xho I酶切位点，双酶切后与经同样双酶切的表达载体pET-32a（+）通过T4连接酶连接，重组质粒pET-32a(+)-scFv转化大肠杆菌Rosetta2TM(DE3）感受态细胞中，用抗性平板（含100μg/mL氨苄青霉素、25μg/mL氯霉素）筛选转化子。从中随机选取100个阳性克隆子，参照1.2.1进行小量诱导表达p53单链抗体。同时，随机挑取50个原始抗体基因表达的阳性重组子进行诱导表达，作为对照组。
1.2.5 ELISA检测抗p53单链抗体亲和力
采用ELISA法检测单链抗体亲和力，具体实验操作如下[15,16]：包被ScFv，于37℃封闭2 h，另设空白对照组和阴性对照组（包被PBS）；加100μL p53蛋白，37℃反应1 h；加洗涤液200μL/孔，洗涤3次，3 min/次；加一抗：加100μL稀释后的p53一抗，37℃反应1 h；加洗涤液200μL/孔，洗涤3次，3min/次；加二抗：加稀释后HRP-羊抗小鼠IgG,100μL/孔，37℃反应1 h；加洗涤液200μL/孔，洗涤3次，3 min/次；显色：加100μL底物TMB，避光条件下37℃反应15 min；终止：加入终止液2 mol/L H2SO4、50μL/孔；测定OD450。
1.2.6 细胞免疫化学法检测抗p53单链抗体亲和力
将HepG2细胞进行传代培养，点样于载玻片中；次日，用4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗涤3次；0.5%Triton透化20 min,PBS洗涤3次；4%H2O2去内源性过氧化物酶透化10 min,PBS洗涤3次；5%脱脂奶于37℃下封闭30 min；加入ScFv于37℃反应1 h,PBS洗涤3次；加入His-tag抗体37℃反应1 h,PBS洗涤3次；加HRP标记的山羊抗小鼠IgG于37℃反应1 h,PBS洗涤3次；加入DAB显色5 min；加入苏木素染色30 s，冲洗后，显微镜下观察拍照。
2 结果
2.1 p53重组质粒的验证
实验室保存的重组质粒pET-27b(+)-p53转化E.coli DH5α后，挑取阳性克隆子进行扩培，提取质粒进行PCR扩增，电泳结果如图1(A）所示，在1200 bp处出现特异性条带。重组质粒用EcoR I和Not I进行双酶切验证，结果如图（B）所示，扩增产物经电泳后出现两条带，在5400 bp处的大片段推测为线性pET-27b（+）质粒，1200 bp处的小片段推测为目的条带p53。
2.2 p53蛋白的诱导表达与纯化
将p ET-27b(+)-p53重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta2TM(DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE检测后如图2(A）所示，与泳道1诱导前相比，加入IPTG诱导3 h后有一条明显增加的条带（图中箭头所示），分子量大小约为53 KDa，这与p53蛋白理论值一致。纯化后，如图2(B）所示，在53KDa处有单一明显条带，说明p53蛋白已得到纯化。
2.3抗p53单链抗体库的构建
经过3次免疫后，小鼠眼珠取血，ELISA法测定血清效价在106以上。提取小鼠脾脏总RNA，逆转录为c DNA。以c DNA为模板，设计重链和轻链可变区简并引物进行PCR扩增。扩增产物电泳后如图3所示，轻链可变区VL-linker片段大小约370 bp，重链可变区VH-linker片段大小约400 bp。等浓度的VH-linker和VL-linker进行重叠延伸PCR拼接反应，扩增完整的Sc Fv片段。如图4所示，扩增产物在750～1000 bp之间有一明显的条带，对目的片段进行胶回收纯化。
2.4 核糖体展示筛选抗体基因
以p53蛋白为筛选抗原，通过核糖体展示技术对构建的ScFv库进行体外转录、翻译和筛选，每轮回收的mRNA作为模板进行下一轮扩增筛选。结果如图5所示，通过5轮筛选，泳道1-5中约750 bp处的目的条带逐渐变亮，而以泳道6和7以PBS和BSA作筛选抗原的对照组没有扩增到目的条带，表明针对p53蛋白的目的基因得到了有效富集。
2.5 抗p53单链抗体原核重组质粒的构建与表达
设计单链抗体基因的上、下游引物，分别在其5’端添加Eco R I和Xho I酶切位点和保护碱基，将有酶切位点的目的基因片段克隆至p ET-32a（+）载体。重组质粒分别用PCR、双酶切的方法进行初步验证，结果如图6所示，经过琼脂糖凝胶电泳后，在约750 bp处出现单一条带，说明单链抗体基因可能已插入p ET-32a（+）载体中。酶切产物出现两个条带，大片段约为5900 bp，推测为线性p ET-32a（+）质粒，小片段约750bp，推测为目的条带。
将pET-32a(+)-scFv重组质粒转化至Rosetta2TM(DE3）宿主菌中。氨苄青霉素抗性平板筛选转化子，挑取单菌落至LB液体培养基中诱导表达。如图7所示，经SDS-PAGE检测后，与泳道1的非诱导菌株相比，重组菌诱导后约在48 kDa处出现比较明显的蛋白条带。
2.6 ELISA法筛选抗p53单链抗体
间接ELISA法检测筛选基因和原始基因表达的抗体蛋白活性。结果如图8(A）所示，原始文库基因表达的蛋白测出的OD450较低，说明表达所产生的抗体特异性较低，很难获得高亲和力的菌株。图8(B、C）所示，经过5轮核糖体展示筛选后的基因，大约有25%的克隆子表达的产物OD450较高，显示与抗原p53有较好的特异性，其中3株抗体p53-ScFv1、p53-ScFv2和p53-ScFv3显示出较高的ELISA值。图8A和图8B中的1、2组分别代表空白对照组和阴性对照组，两组OD450值均低于0.2，三株单链抗体的OD450均高于空白组和阴性对照组（P<0.05)，说明这三株单链抗体对抗原p53具有一定的亲和力。
2.7 细胞免疫学检测抗p53单链抗体
复苏培养HepG2细胞，待细胞贴壁生长后，将其进行免疫细胞化学实验，检测ScFv与p53蛋白的结合能力。显微镜观察染色效果如图9,(A）为HepG2细胞的核染结果，实验过程中设定阴性对照组（B）。如图（C）、（D）、（E）所示，三株单链抗体能与细胞中p53抗原相结合。
3 讨论
p53蛋白的免疫组化是病理科常用的诊断手段，通过检测获取的癌症组织中p53蛋白的表达情况，对早期的肿瘤诊断、预后以及制定治疗方案都具有十分重要的意义。p53蛋白的检测最主要的是获得单克隆抗体进行免疫组化相关实验，但单克隆抗体制备复杂、成本较高，使其应用受到限制[17]。
随着基因重组技术的发展，单链抗体成为近年来抗体研究的热点。通过将抗体的重链可变区和轻链可变区进行拼接，使其有分子量小、制备简单且穿透力强等优势[18]。单链抗体的制备主要通过传统杂交瘤技术或展示技术来获得[19]。其中，核糖体展示技术作为一种体外展示技术，跟体内展示技术相比，其更易于构建大容量抗体库。抗体库的构建只需通过PCR扩增，筛选在体外进行，不受细胞的限制，避免了细胞融合等传统抗体制备的复杂操作。该技术将基因型和表型偶联在一起，利用相应的抗原即可筛出目标蛋白并获得相应的基因型，可以针对大容量基因库进行高效筛选[20]。
因此，本研究选择免疫小鼠的脾脏细胞作为材料，建立核糖体展示文库。通过TNT T7 Quick for PCR DNA系统对文库进行转录和翻译，生成“mRNA-核糖体-单链抗体”复合体。在下一步的亲和筛选过程中，包被抗原p53蛋白，利用抗原抗体的特异性，5轮筛选后回收目的基因。将筛选获得的抗p53单链抗体基因和原始抗体基因进行原核表达，采用间接ELISA检测抗体特异性。结果表明，经过核糖体展示筛选后的单链抗体基因，约有25%表达出的抗体与抗原有较好的特异性。其中，亲和力较高的三株p53-ScFv1、p53-ScFv2和p53-ScFv3在细胞免疫学检测到中均能与HepG2细胞中p53抗原相结合。
综上所述，利用核糖体展示技术可获得抗人p53单链抗体，且具有良好的亲和力和组织穿透力。相比传统抗体制备，有费用低廉，操作简便等优势，可用于免疫组化等研究，该技术为免疫检测抗体的筛选制备提供了新的思路和途径。
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